Metabolismo y rendimiento de los cultivos sobre superficies sólidas .

1. Metabolismo y rendimiento de los cultivos sobre superficies sólidas. Gustavo Viniegra González Universidad Autónoma Metropolitana, Iztapalapa, D.F. MEXICO (vini@xanum.uam.mx)

2. Esquema metabólico global Biomasa -DSX = DX/YC ATP Biosíntesis -DSin = DX/Yin Consumo total – DST= SO – S Respiración -DSQ = DX/YQ ATP  Mantenimiento -DSin =mXDt Productos  -DSP= DX/YP

3. Balance metabólico Consumo = Biosíntesis + Producción + Mantenimiento Balance: YX/S = gX/gS; YX/P = gX/gP; Yp/S = gP/gS Si DSP = 0;  (Modelo de J. Pirt)

4. Ciclo de vida de un moho Crecimentovegetativo Germinación Esporulación Crecimiento aéreo Diferenciación

5. Modelo macroscópico • La tasa específica de crecimiento, r, está definida como r = (1/rA)drA/dt Se supone que, r, se anula cuandorA, se aproxima a, rAmax. Modelo de vonBertanlanffy r = m{1 – (rA/rAmax)n} rA << rAmax r  m; rA  rAmax, r  0

6. Liberación de calor enla FMS de A. niger sobre bagazo de caña, conglucosa. • Dos picos de calor: germinación y crecimiento. • Crecenconlaconcentracióndelsubstrato. Datos de Oriolet al.

7. Medición de CO2 y O2 Componentes: • Columnas de FMS. • Cromatógrafo de gases. • Computador. Beauveriabassiana sobre cutícula de grilo Tesis de D. Rodríguez, UAM (2009)

8. Respiración, metabolismo y crecimiento de A. niger vs. aw Harina de yuca y bagazo de caña, aw, aumenta por laadición de glucosaenelbagazo. Superior Respiración y consumo de substrato enla FMS Inferior • aumenta com aw () Germinación() más breve com mayoraw Datos: E. Oriolet al.

9. FMS con suporte inerte A. nigerenbagazo de caña, conjarabe de glucosa. El hongocreciócon400 g/L de glucosa!

10. Cultivo de Verticilliumlecanii sobre cutícula de grillo J.E. Barranco-Florido et al. / Enzyme and Microbial Technology 30 (2002) 910–915

11. Respiración de Beauveriabassiana Salvado de trigo o cutícula de grilo. Dos fases respiratorias (Ikasari y Mitchell, 2000) • Crecimiento exponencial b) Autólisis de parte de labiomasa Datos: D. Rodríguez, tesisdoctoralenla UAMI, 2009

12. ATP biosíntesis -DSx = DX/YX Respiración -DSQ = DX/YQ ATP  mantenimiento -DSm =mXDt Productos -DSP =YPDX + bXDt b está ligada à mantenimiento Balance respiratório Si losflujosde O2 y S estánequilibrados, → m/ << 1, (DSP= 0) Y, const.. DS/DX = 1/Y+m/m  1/Y

13. Cociente respiratorio • CR = DCO2/DO2 • Ejemplos: C6H12O6 + 6O2 6 CO2+ 6H2O CR = 6/6 = 1 C6H12O6 + 2O2  2C2H4O2+ 2CO2 + 2H2O CR = 2/2 1 Es una indicación del tipo de metabolismo.

14. Modelo respiratorio* • Se, X < XC (crecimiento exponencial) • Se, X  XC ; t  tC(autólisis parcial) Biomassa X = X(activa) + X(inactiva) C. Lareoet al. / Enzymeand Microbial Technology 38 (2006) 391–399

15. Crecimiento y Respiración de Mucorbacilliformis • Poliuretano. • Crecimiento exponencial conGlucosa (100 g/L) • Esporulación si el substrato se agota. C. Lareoet al. / Enzymeand Microbial Technology 38 (2006) 391–399

16. Cultivo de Gibberellafujikuroiipor FMS Amberlita • Substrato: Almidón (189 g/L) • La giberelinaesproducidadespués de que disminuyelarespiración. C. Gelmi et al. : Process Biochemistry 35 (2000) 1227–1233

17. S S S 6O2 2NAD 6NAD  6NADH2 C6H12O6 6CO2 6H2O2 2NADH2 2CH3CH2COOH O2 O2 O2 O2 Septo N Spitzenkörper O2 O2 O2 O2 S S S 6H2O2→6H2O +3O2 catalases e peroxidases

18. Lasespeciesreactivas de oxígeno (ROS) • “La diferenciación … es una respuestaalestrésoxidativo”*. *Hansberg and Aguirre, 1990; Aguirre et al., 2005.

19. Las hifas vegetativas aireadas se pegan para formar hifas aéreas. Secreciónde polisacáridos (PS) logX → ← PS A/V = 5 ← PS A/V = 1

20. El O2inducelaformación de las hifas aéreas “Cuando se aumentan o decrecenlasconcentraciones de oxígeno, ... Se observan, respectivamente, cantidades aumentadas o disminuídas de hifas aéreas ...” +H →Airhúmedo, -H →Air seco, airO2→ 50% O2, airN2→ 50% N2 (Brit. Mycol. Soc. Symp. Series27: 235-257, 2008)

21. La catalasa 3 de N. crassa regula los ROS ligados a ladiferenciación. La mutante negativa, cat-3RIP, produce más hifas aéreas que Wt y más fotonesasociados a laproducción de ROS. (Brit. Mycol. Soc. Symp. Series27: 235-257 2008)

22. La red regulatoria de la respuesta a los ROS en levaduras es muy compleja. Mcs1, Mcs2 e Mcs4 responden a H2O2. MAPK fosforila proteínas regulatorias. Cadena de respuestasgénicas. Tomado de: Aguirre et al., Trends in Microbiology. 13(3): 111 ,2005.

23. Modelo del impedimento estérico* • Densidade máxima, rmax 50 mg (sólidos)/cm3. • Contenido de sólidos r0  150 mg /cm3. • 2/3 de porosidad (aire) • Para elintercambio de O2 y CO2. *Laukevics et al. B & B, 27: 1687 (1985). Dados de Nopharatana et al. B & B, 84: 71 (2003); Fotografía: D. Rodríquez, 2008

24. Relación entre densidades de superficie, rA, y de volumen, rV. rV = g/cm3 ; rA = g/cm2, h = cm; rV = rA/h densidad de volumen = • densidad de superficie/espesor O2 hc 0.01 cm rV 0.05 g/cm3 rA=rVh≤ 0.01 g/cm2 h  0.2 cm  hc h S0 S0

25. Agotamientodel O2 por R. oligosporuscrecidoencajaPetri hC = 60 mm; espesor de la capa crítica para el O2

26. ¿Como se calculará elespesor crítico (hC) de unmicelio? z z = hC C = C0(1-z/hC)2

27. Comentario sobre hC • El valor de, hC = 0.01 cm = espesor de la capa aeróbica. • Fué medido conelectrodossensibles a oxígeno. • El valor h hC, eselespesor de las capas aeróbica y anaeróbica

28. Integración de los modelos • El micelio crece exponencialmente con un balance redox (Difusión = Consumo). • Al llegar a un nivel rV < 0.05 g/cm3, la difusión de O2 es más lenta que su demanda. • La penetración del oxígeno es, hC < 0.01 cm. • El micelio con h > hC, es anóxico y no produce más biomasa, pero consume y transporta sustrato.

29. Crecimiento en capa fina La capa aerobia con espesor, hC, crece hasta que rV = rVmax O2 O2O2O2 La capa anaerobia consume substrato sin crecer. Yx/s decrece si, d hC hC Capa aerobia  Capa anaerobia  Agar con substrato  d S SSSSS

30. Definición de s0 (g/cm2) • S0 = concentración del sustrato dentro del soporte (g/cm3). • A = área del soporte (cm2) • V = volumen del suporte (cm3) • s0 = S0V/A (g/cm2) • s0 = Sustrato inicialmente disponible en toda la superficie de contacto con el micelio. • a = A/V (área específica); s0 = S0/a

31. Cálculos de a • Placa con espesor, H;  a = 1/H Ejemplo: placa de agar H = 1 cm; a = 1/cm • Cilindro con diámetro, d;  a = 4/d Ejemplo: fibra con d = 0.1 cm; a = 40/cm • Esfera con diámetro, d;  a = 6/d Ejemplo: esferas con d = 0.02 cm; a = 300/cm

32. Volúmenes específicos (A/V) Matraz de 250 mL con V = 50 mL de agua Menisco de 0.06 cm de espesor A/V = 2/cm A/V = 333/cm

33. A. nigeren PUF con glucosa ¿Por qué la pendentees fija para FMS ()? YX/S = 0.35 gX/gS ¿Por qué es variable para FSm ()? 0 < S0< 100g/L Datos de SJ Romero, 2001

34. Crecimiento de A. niger en caja Petri. • rA h  rV = rA/h rV no varía con s0 1/Y = 1/Y0 + s0/e Y0 = 0.5; si s0<< e (capa aeróbica) e = rVhmax = rAmax rA Datos de E. Ortega, 2012

35. Crecimiento en capa fina La capa aerobia con espesor, hC, crece hasta que rV = rVmax O2 O2O2O2 La capa anaerobia consume substrato sin crecer. Yx/s decrece si, d hC hC Capa aerobia  Capa anaerobia  Agar con substrato  d S SSSSS

36. Modelo de Nopharatana et al. (1998, 2003)* El micelio aerobio crece h < hC hasta que rV rVmax La capa aerobia sigue creciendo y formando nuevo micelio. La capa anaerobia transporta sustrato (translocación) El modelo no explica los resultados experimentales con Rhyzopusoligosporus(vea el Problema 3). *Biotechnol. Techniques,12(4): 313–318, 1998; B & B 84(1): 71-77, 2003

37. ¿Qué controla las densidades de loshongos? Diferentes e1con distintas cepas de A. niger. Diferentes e2conlamisma cepa de A. niger y diferente soporte. e1 (mg/cm2) = 15, vs.75; e2= 0.8, vs. 74

38. Efecto de cepa y soporte sobre e Las mutantes con menor eficiencia, tendrán e menor. Los soportes con menos espacio intersticial tendrán e menor. • mide la máxima producción de biomasa sobre la superficie. Cuando s0 < 1 mg/cm2 el rendimiento es máximo y similar para diferentes cultivos.

39. Consecuenciasdel modelo • Dos fases respiratórias exponenciales: creciente y decreciente. • La 1ª → metabolitos primários; la 2ª → metabolitos secundários, → esporulación. • Transición: acumulación de espécies reactivas de oxígeno (ROS). • La variación de s0 controla elespesor y tipo de metabolismo de la capa fúngica.

40. Aplicaciones: • Controlrespiratorioen línea →control de la FMS. • El O2 limita ladensidad y espesor de labiomasa sobre superfícies sólidas. • Pulsos de O2 esporulación.

41. Los pulsos de O2 aumentan la esporulación en superficie • Metarhiziumanisopliae var. lepidiotum Tecuitl-Beristain et al. Mycopathologia (2010) 169:387–394

42. Problema 1 ¿Cuántas bandejas por lote quincenal se requieren para producir esporas de M. anisopliae, aplicadas en 5,000 Ha?¿Cuántas Ha cubrirá esa fábrica en 300 días? Datos: 1.36 kg (MS) de salvado de trigo por bandeja con partículas cúbicas de 0.05 cm de arista y 60% de humedad. C = 3x107 esporas por cm2. Cada Ha requiere 1012 esporas

43. Problema 2 Columnas con gránulos esféricos de almidón (d = 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 cm) y sales minerales. El almidón retiene una vez su volumen de agua y se degrada en un 80%. Un cultivo de A. niger, produce rendimientos Y = 0.69, 0.32, 0.24, 0.16 (gX/gS). Calcule, el área total de 1 kg (húmedo) de gránulos con d = 0.15 cm y densidad del sustrato 1.2g/cm3 Calcule e y estime la biomasa producida con ese d.

44. Problema 3 Compare los artículos de Oostra et al. (2001) y Rahardjo et al. (2002) sobre hC. Diga por qué los perfiles de oxígeno en el micelio explican las diferencias entre el modelo de Nopharatana et al. (1998) y sus resultados de 2003. ¿Cómo se imagina la capa de Rhyzopusoligosporus?

45. Problema 4 Explique por qué los cultivos aireados de A. niger sobre partículas de agriolita, pueden metabolizar jarabes hipertónicos de glucosa (300 g/L). Suponga que las partículas tienen A/V = 50/cm y que Y0 = 0.5, e = 0.001 g/cm2. Calcule Y. Discuta qué tipo de metabolismo estará ocurriendo. ¿Cómo será el cociente respiratorio? Revise el Balance Metabólico