β-glükozidáz aktivitás mérése talajban

1. β-glükozidáz aktivitás mérése talajban

2. Enzimek • globuláris fehérjék • jellegzetes térszerkezet specifikusság • biológiai katalizátorok: vagy egy reakciótípust vagy egy bizonyos anyag átalakulását katalizálják • a reakciók lebonyolításában az aminosav-oldalláncok által kialakított aktív centrum vesz részt

3. Az enzimek működése • egy enzimkatalizált reakcióban az enzim aktív centrumában ideiglenesen megköti a szubsztrátot és létrejön egy enzim-szubsztrát komplex • a reakció lejátszódásával termék keletkezik, amely leválik az enzimről, majd az enzim visszakerül eredeti állapotába • függ: kémhatás, hőmérséklet

4. Az enzimek működése 1. ábra: http://hu.wikipedia.org/wiki/Enzim

5. Enzimaktivitás • az enzim mennyiségét az enzimaktivitással szokták jellemezni • tulajdonképpen reakciósebességet jelent, vagyis azt jelenti, hogy a jelen levő enzimmennyiség szigorúan meghatározott szubsztrát koncentráció mellett, időegység alatt, mennyi szubsztrát átalakulását katalizálja • egysége: 1 µmol/perc, catal

6. Enzimaktivitást befolyásoló tényezők • enzimkoncentráció • szubsztrátkoncentráció • kémhatás • hőmérséklet • inhibitorok, aktivátorok

7. β-glükozidáz • mikroorganizmusokban, növényekben és állatokban is egyaránt megtalálható • hidroláz enzim • a cellulózt hidrolitikusan hasítja glükóz molekulákká • a diszacharidokathidrolizálóglükozidázok csoportjába tartozik • a talajban sokkal nagyobb jelentőségű, mint az ugyanebbe a csoportba tartozó α- glükozidáz és α- és β-galaktozidáz

8. Hidrolízis • a hidrolizáló enzimek víz belépésével két részre hasítják a szubsztrátmolekulákat • a szubsztrátmolekulák egy részét az OH- csoportra viszik át, míg a víz protonja a szubsztrátmolekula másik részére kerül 2. ábra: Alef K. and Nannipieri P. : Methods inApplied Soil Microbiology and Biochemistry

9. β-glükozidáz aktivitás mérése • leggyakrabban p-Nitrofenil-β-d-glükozidot használnak szubsztrátként • ennél a szubsztrátnál Km értéke általában 1,3-2,4 mM (Michaelis-állandó (Km): az a szubsztrátkoncentráció, amelynél a maximális ( vmax) felét éri el a reakciósebesség) • 70°C-on inaktiválódik és jelentős összefüggést mutat a talaj szeversanyagával

10. β-glükozidáz aktivitás vizsgálata(Tabatabai 1982; Eivazi és Tabatabai 1988) • alapja a p-nitrofenol csökkenésének meghatározása, a talaj p-nitrofenil glükozid oldat inkubációja után • az inkubáció időtartama 1 óra; hőmérséklet: 37 °C 3. ábra: Alef K. and Nannipieri P.: Methods inApplied Soil Microbiology and Biochemistry

11. Szükséges eszközök és anyagok Eszközök Anyagok • Spektrofotométer • Erlenmeyer lombik (50 ml) • 37°C –os vízfürdő, rázató • Szűrőpapír • Toluol • MUB (modifieduniversalbuffer) puffer (pH=6) • 0,5 M CaCl2 • 0,1 M TRIS puffer (pH=12 és 10) • Standard p-Nitrofenol oldat • 25 mMp-Nitrofenil-β-d-glükozid (PNG) oldat (0,377 g PNG-t 40 ml MUB pufferben oldva, 50 ml-re hígitva)

12. A mérés metodikája • 1g nedves talajt Erlenmeyer lombikba helyezünk, majd hozzáadunk 0,25 ml toluolt, 4 ml MUB oldatot és 1ml PNG oldatot • lezárva 1 órán keresztül 37°C-os rázatóban inkubáljuk • az inkubáció után hozzáadunk 1 ml CaCl2 oldatot , 4 ml TRIS puffert (pH=12), összekeverjük a lombikban és szűrőpapírral azonnal leszűrjük a szuszpenziót • spektrofotométerrel 400 nm-en megmérjük az intenzitást (ha túl magas, azaz nem fér bele a mérhető tartományba, akkor pH=10-es TRIS pufferrel hígítani kell a szűrletet) • vakoldat készítése • mérés megismétlése 3x (ugyanahhoz a vakoldathoz)

13. β-glükozidáz aktivitás vizsgálata(Hoffmann és Dedeken 1965) • alapja a salignin (2-oxymetil-fenol) csökkenésének meghatározása salicin 2-( hidroximetil)fenil –β-D-glükopiranozid (β-glükozid salignin) talajban történő inkubálása után • az inkubálás időtartama 3 óra;hőmérséklet: 37 °C

14. Szükséges anyagok és eszközök Anyagok Eszközök • 2 M acetát puffer (pH=6,2) • Borát puffer (pH=9,6) • Dibróm-kinon -klórimid oldat (200 mg 100 1/ml etanol) • 2,306 g β-glükozid salignin oldat • Standard salignin oldat (0,1 mg/ml) • toluol • Spektrofotométer • Mérőlombik (50 ml) • 37 °C-os vízfürdő, rázató • Szűrőpapír

15. A mérés metodikája • mérőlombikba 5 g nedves talajt helyezünk, majd hozzáadunk 1 ml toluolt és 15 percig állni hagyjuk, szobahőmérsékleten • ezután hozzáadunk 10 ml-t a szubsztrát oldatból és 20 ml acetát puffert, majd 3 órán keresztül 37°C-on inkubáljuk • az inkubálás után desztillált vízzel 50 ml-re hígitjuk, összekeverjük és leszűrjük • a szűrletből 1-3 ml-t mérőlombikba pipettázunk és hozzáadunk 20 ml acetát puffert, 2 ml borát puffert és 0,5 ml dibróm-kinon-klórimid oldatot • desztillált vízzel 50 ml-re töltjük és 90 perc után, 578 nm-en mérjük az abszorbanciát • a vakoldat elkészítéséhez 10 ml desztillált vizet adunk a szubsztrát helyett • a mérést háromszor megismételjük (ugyanazzal a vakoldattal)

16. Felhasznált irodalom: • Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods inApplied Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press Limited. London. 1995 • Boross László, Sajgó Mihály: A biokémia alapja. Mezőgazda Kiadó Kft. 2003 • Ádám Veronika: Orvosi biokémia. Medicina. 2004 • Sarkadi Lívia: Biokémia mérnök szemmel. Typotex. 2007 • http://hu.wikipedia.org/wiki/Enzim