“Antigenic drift” como mecanismo de evasión tumoral hacia los Linfocitos T citolíticos

1. “Antigenic drift” como mecanismo de evasión tumoral hacia los Linfocitos T citolíticos Emilio Flores Pardo

2. Introducción: • Las mutaciones en epitopos de Ag virales permiten a los virus escapar del reconocimiento de Ac y linfocitos T. • En las células tumorales no queda muy claro como consiguen escapar al reconocimiento por parte del sistema inmune. • Se han descrito muchos mecanismos, en virus y tumores, capaces de ayudar a la evasión de las células T citolíticas: • Ingnorancia del sistema inmune. • Inducción de anergia clonal de células T especícicas frente a un tumor. • Regulación negativa en la presentación de Ag. • Pérdida de la expresión de tumores Antigénicos. • No queda claro como mutaciones en epitopos antigénicos en células tumares contribuyen a la evasión del sistema inmune.

3. Introducción (II) • El estudio de ratones en los que se modifica genéticamente células T para que expresen un solo epitopo antigénico, ayuda a establecer el mecanismo de reconocimiento de esa célula T. • Seleccionando una línea transgénica de ratón, que exprese un TCR específico frente a un determinado tumor, se puede estudiar el mecanismo de resistencia que presenta frente a un determinado quimioterápico. • Estas mutaciones podrían ser moduladas: • Péptido de unión al MHC. • Complejo MCH : complejo peptídico del TCR

4. En el Método se describe: • Animales de experimentación: Ratones transgénicos que expresaban un TCR especícico para el tumor antigénico: H-2:P1A35-43. • Producción de cadenas alfa de TCR en ratones transgénicos: Clon de CTL reactivo a P1A. • Líneas celulares: • Transferencia de células T transgénicas: Pools de bazo y nódulos linfoides de los ratones transgénicos incubados con un Ac y separados con otro anti-Ac. • Caracterización molecular del Ag P1A de las líneas celulares nativas y linfocitos T citolítcos resistentes a los tumores. Utiliza RT-PCR. • Sintesis de péptidos tanto los nativos como los mutantes. • Citometria de Flujo. • Proliferación de ensayos. • Citotoxicidad de ensayos.

5. Resultados: • La terapia en monoclonales de células T transgénicas, provoca distintas resistencias tumorales. • Terapia con P1CTLs(antitumoral) muestra una reducción del 60 % del tumor durante la primera semana, pero en la segunda semana el tumor sigue creciendo resistiendo.(fig.a) • Los CTL son activos frente a la línea celular original, pero no ante otras 2 generadas a partir de la nativa (fig b). • A pesar de que expresen ambas lineas tumorales el mismo AgP1. (fig c) • Y que superficie niveles similares de H-2L a la línea tumoral nativa. (fig d)

6. Estos resultados demuestran que terapia con CTL activos frente a P1 seleccionan mutantes resistentes al tratamiento, aunque no pierden la expresión de moléculas de superficie del MCH o la expresión P1.

7. Alteraciones moleculares de genes de P1A en genes tumorales se elevan con la terapia monoclonal. • Se secuenciaron 5 clones (fig a) de P1A de CTL resistentes al tumor y se compararon con la forma nativa. Se encontraron mutaciones y se intentaron identificar: • Se identificaron 2 enzimas de restricción capaces de reconocer la mutación. (fig b) • Se valoró la expresión del gen P1A en los clones tumorales po PCR, RT-PCR y RT. (fig c)

9. Bases inmunológicas de la perdida de respuesta en la terapia monoclonal. • Consecunecias de estas mutaciones en las nativas y mutantes: • Las mutantes inducen menos proliferación. Fig b • Son más resistentes a la citolisis. Fig c • Los peptidos mutantes son Antagonistas para P1A. Fig d

10. Figura a: representa los distintos tipos de péptidos, P1A nativo, ○ control (citomegalovirus) y el resto de peptidos mutantes.

11. Susceptibilidad específica a la la lisis por Linfocitos T citotóxicos de la línea nativa y los distintos mutantes.

12. La disminución del reconocimiento de peptidos Ag puede ser debida dos causas: • La unión del MHC • Complejo MHC – péptido:

13. P1A(6R) es algo menos potente que el péptido nativo en la estabilización de H-2L. • Mutaciones en P7 y P8 incrementaron la unión a H-2L

14. Efectos de la alteración de los péptidos sobre la unión de P1A específico de células T al H-2L: Complejo péptidico. (Mediación de los efectos de las mutaciones sobre el reconociminento de células T) • Caracterización de los ratones transgénicos que expresan un TCR específico para P1A. Fig a • Representación gráfica del complejo MHC-Péptido de células T. Fig b • Comparación cuantitativa de la avidez del complejo nativo y mutante H-2:P1A. Fig c

15. Células T transgénicas policlonales que expresan TCR con cadena alfa reactivo frente a P1A, selecciona clones con variantes antigénicos in vivo. • La expresión de P1CTL TCR de cadena alfa se produjo en más del 90% de células T. fig a • Evolución del tamaño del tumor en función del tipo de tratamiento (TCR-alfaTG)

17. DISCURSION: • Antigenic drift podría ser el mejor mecanismo de evasión del sistema inmune en virus, no se conoce muy bien su contribución en tumores, pero no ha podido ser bien analizada hasta ahora por: • Rápida replicación e inestabibildad del genoma. • Diferentes respuestas del sistema inmune a virus y tumores • Es muy dificil carcaterizar todos los antígenos tumorales, hay una perdida de claridad en los espectros de tumores que hace muy difícil analizar los distíntos tipos de mutaciones

18. La línea tumoral no presentaba alta frecuencia de mutación de los epitopos antigénicos P1A: • El análisis de 37 clones por mapeo y secuenciaciación no mostró mutaciones en los epitopos antigénicos. • Se intento repetidamente la selección de mutantes P1A activos. Las mutaciones en el P1A epitopo no se presentan con una alta frecuencia (inferior a 1/5*107) • Las células aisladas de RAG2-/- de ratón, que no recibieron terapia no presentaron mutaciones.

19. El trabajo demuestra que además de la pérdida antigénica y de MHC, la antigenicidad de los tumores puede estar alterada por antigenic drift. • Muchos virus y tumores pueden evadir su destrucción por las mutaciones de sus epitopos.

20. Algunas propiedades de P1A: • Hay una correlación entre la unión del complejo H-2L:péptido de la TCR y la propiedad de inducir respuestas de células T . • La intensidad de la unión de MHC: unión peptídica no siempre se correlaciona con la función biológica. • La mejor caracterización de los espectros antigénicos permitirá el estudio de el mecanismo de antigenic drift.

21. Los resultados demuestran que la mutación antigénica de los tumores es un mecanismo de evasión de la terapia con Linfocitos T citotóxicos in vivo