Xylose Isomerase EC 5.3.1.5

1. Xylose IsomeraseEC 5.3.1.5 Oleh: Hairunnisa – 20512007 Florence A. Husada – 20512057 Mata Kuliah KI-6161 Enzimologi November 2012

2. Agenda Presentasi • Pendahuluan 1 Struktur & Mekanisme Reaksi 2 Kinetika Enzim 3 Isolasi & Pemurnian Enzim 4 Aplikasi di Industri 5 6 Modifikasi Genetika

3. Xylose IsomeraseEC 5.3.1.5 • EC 5 : Class Isomerase EC 5.3 : Subclass Intramolecular Oxidoreductases EC 5.3.1 : Subsubclass Interconverting Aldoses & Ketoses EC 5.3.1.5 : Xylose Isomerase • Katalisis reaksi reversibel dalam isomerisasi • D-xylosa menjadi D-xylulosa. • D-glukosa menjadi D-fruktosa (beberapa enzim). • Memiliki nama lain:D-xylose isomerase; D-xylose ketoisomerase; D-xylose ketol-isomerase; D-Glucose Isomerase • Nama sistematik: D-xylose aldose-ketose-isomerase • http://www.ebi.ac.uk/intenz/query?cmd=SearchID&id=4943&view=INTENZ (11 November 2012 pukul 7.25 WIB) • http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC5/0301p.html#0105 (11 November 2012 pukul 7.25 WIB)

4. Sejarah Xylose Isomerase • Berdasarkan sejarah, ditemukan 4 tipe enzim yang diklaim memiliki aktivitas isomerisasi glukosa. • 1957 – starting point; ditemukannyaenzim pada Pseudomonas hydrophiladengan kemampuan mengisomerisasi glukosa oleh Marshall & Kooi. • Ditemukan aktivitas xylose isomerase pada Escherichia intermedia. [Diketahui kemudian sebagai phosphoglucoseisomerase(EC 5.3.1.9)]. • Takasaki & Tanabe mengisolasi glucose isomerase (GI) (EC 5.3.1.18) dariBacillus megaterium AI ayang terikat pada NAD dan spesifik terhadap glukosa.

5. Sejarah Xylose Isomerase • Berdasarkan sejarah, ditemukan 4 tipe enzim yang diklaim memiliki aktivitas isomerisasi glukosa. • Aktivitas GI yang sama diisolasi dari Paracolobacteriumaerogenoidesyang dapat mengkatalisis isomerisasi pada glukosa dan mannosa menjadi fruktosa. • Dari sekian banyak yang ditemukan, Xylose Isomerase (EC 5.3.1.5) yang sangat cocok untuk dikomersialkan.

6. Sejarah Xylose Isomerase • 1967 – Clinton Corn Processing Co., USA, pertama kali membuat isomerisasi glukosa enzimatik skala industri. • 1980 – Kebutuhan high-fructose corn syrup (HFCS)dalam industri makanan meningkat, akhirnya seluruh perusahaan pengolah pati beralih menggunakan teknologi enzim.

7. Sumber Xylose Isomerase: Prokariot

8. Sumber Xylose Isomerase: Prokariot

9. Sifat Xylose Isomerase • Spesifisitas Substrat • Mampu mengubah D-ribose, L-arabinose, L-rhamnose, D-allose, dan 2-deoxyglucose, seperti substrat yang biasanya digunakan, yaitu D-glucose dan D-xylose (afinitas tertinggi). • Rasio konversi(D-glucose →D-fructose)= 26 – 59% (dari berbagai organisme). • Nilai KMuntuk D-glucose= 0.086 – 0.920 M • Nilai KM untuk D-xylose= 0.005 – 0.093 M

10. Sifat Xylose Isomerase • Kofaktor dan Inhibitor • Kofaktor:Mg2+, Co2+,Mn2+, atau gabungan dari ketiganya. • Mg2+dan Co2+bertindak sebagaiaktivator,Co2+sebagai penstabilkonformasi enzim. • Inhibitor Logam: Ag+, Hg2+, Cu2+, Zn2+, Ca2+,dan Ni2+ • Inhibitor Nonlogam: xylitol, arabitol, sorbitol,mannitol, lyxose, danTris.

11. Sifat Xylose Isomerase • Suhu dan pH Optimum • Range suhu optimum = 60 – 80°C (akan meningkat jika ada ion Co2+). • Range pH optimum = 7,0 – 9,0. • Studi Active-Site • Melalui X-ray crystallography diketahuihistidin dan guguskarboksilat ditemukan pada sisi aktif.

12. Kelebihan Xylose Isomerase • Heat-stable • Tidak membutuhkan kofaktor yang mahal, seperti NAD+atau ATP. • Meskipun afinitas enzim untuk glukosa 160x lebih kecil dibandingkan xylosa, tetapi enzim ini masih sangat menguntungkan secara komersial dibandingkan dengan isomerisasi secara kimia.

13. VS Chemical Conversion Enzimatic Conversion Dapat bekerja pada pH dan suhu lingkungan. Reaksi spesifik. Tidak menghasilkan produk samping. Rasa fruktosa lebih manis. • Membutuhkan suhu dan pH tinggi. • Reaksi tidak spesifik dan cenderung membentuk produk samping yang tidak diinginkan. • Sulit memperoleh [fruktosa] > 40%. • Rasa fruktosa tidak enak dan kurang manis.

14. Struktur Xylose Isomerase • Berat Molekul bervariasi, antara 52,000 to 191,000 Da. • Subunit struktur= trimer, tetramer, dimer, atau subunit yang identik (terikat secara non-kovalen).

15. Mekanisme Reaksi Sumber: Bhosale, S. H., Rao, M. B., dan Deshpande, V. V., 1996

16. Kinetika Xylose Isomerase • Dilakukan pengamatan terhadap pembentukan D-fruktosa sebagai fungsi waktu inkubasi dengan konsentrasi D-glukosa awal. • Data mengindikasi afinitas D-glukosa terhadap enzim lebih rendah daripada D-xylosa. • D-glukosa (KM=0,5 M pada pH 8,0 dan 40°C). • D-xylosa (KM=3x10-3M pada pH 7,5 dan 30°C). • Suhu optimum ditentukan pada konsentrasi D-glukosa 0,2 M = 42 – 43°C. Sumber: Marshall, R. O. and Kooi, R. E., 1957

17. Isolasi Xylose Isomerase dari Streptomyces Sumber: Srivastava, P., Shukla, S., Choubey, S. K., and Gomase, V.S., (2010)

18. Pemurnian Xylose Isomerase • Pemurnian dapat dilakukan menggunakan metode • Heat treatment, • Precipitation menggunakan garam amonium sulfat-aseton-Mg2+ atau Mn 2+, • Kromatografi penukar ion, • Gel filtrasi, dan • Kromatografi afinitas.

19. Aplikasi di Industri • Produksi Bioetanol • Interconversiondarixylosamenjadixylulosa menyediakan nutrisi yang dibutuhkan bakteri saprofitik untuk melakukan pembusukan material tanaman dan biokonversi hemiselulosa menjadi bioetanol. Sumber: http://www.biolsci.org/v05p0500.htm (11 November 2012 pukul 22.30 WIB)

20. Aplikasi di Industri • Produksi High-fructose Corn Syrup (HFCS) • HFCS (glucose:fructose = 1:1) 1.3 kali lebih darisukrosadan 1.7 kalilebih manis dari glukosa. • Harga HFCS 10 to 20% lebih rendah dari pemanis sukrosa dan tidak akan mengalami penggumpalan seperti sukrosa. • Baik digunakan untuk penderita diabetes karena direabsobsi secara perlahan oleh perut dan tidak berpengaruh pada kadar glukosa dalam darah. • Biasa digunakan pada beverage, baking, canning, dan confectioneryindustries.

21. Aplikasi di Industri • Produksi High-fructose Corn Syrup (HFCS) Sumber: Bhosale, S. H., Rao, M. B., dan Deshpande, V. V., 1996

22. Modifikasi Genetik untuk Meningkatkan Produksi Enzim • Dicapai dengan melakukan strain improvement melalui mutagenesis atau teknologi DNA rekombinan. • Hasil dari beberapa modifikasi genetik: • Peningkatan jumlah enzim sebesar 60%melalui mutagenesisStreptomyceswedmorensisdenganethyleneiminedan N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine. • UV irradiation terhadapStreptomycesolivochromogenesmenghasilkanstrain mutandengan peningkatan aktivitas 70%. • Mutanyang dimutagenesis denganethyl methanesulfonatemenghasilkan1,500 U/mL enzim ketika ditumbuhkan pada media berisi glukosa saja, sementaraparentmemproduksi10 U/mLdengan kondisi yang sama. Sumber: Bhosale, S. H., Rao, M. B., dan Deshpande, V. V., 1996

23. Daftar Pustaka • Bhosale, S. H., Rao, M. B., dan Deshpande, V. V., (1996), Molecular and Industrial Aspects of Glucose Isomerase, Microbiolology and Molecular Biology Review, 60(2):280, p. 280 – 300. • Marshall, R. O. and Kooi, R. E., (1957), Enzymatic Conversion of D-Glucose to D-Fructose, Science, Vol. 125, No. 3249 (Apr. 5, 1957), p. 648 – 649. • Srivastava, P., Shukla, S., Choubey, S. K., and Gomase, V.S., (2010), Isolation, Purification & Characterization of Glucose Isomerase Enzyme form Streptomyces species isolated from Parbhani Region, Journal of Enzyme Research, ISSN: 0976–7657 & E-ISSN: 0976–7665, Vol. 1, Issue 1, p. 01 - 10. • http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC5/0301p.html#0105 (diakses pada 11 November 2012 pukul 7.25 WIB) • http://www.brenda-enzymes.org/php/result_flat.php4?ecno=5.3.1.5 (diakses pada 11 November 2012 pukul 7.25 WIB) • http://www.ebi.ac.uk/intenz/query?cmd=SearchID&id=4943&view=INTENZ (diakses pada 11 November 2012 pukul 7.25 WIB) • http://www.biolsci.org/v05p0500.htm(diakses pada 11 November 2012 pukul 22.30 WIB)

24. Thank You..