DNA reparatsioon. DNA kahjustuste allikad.

1. DNA reparatsioon. DNA kahjustuste allikad. DNA-d kahjustatakse pidevalt nii rakusiseste protsesside kui ka välistegurite poolt. Hinnanguliselt toimub inimese igas rakus iga päev 10000 kuni 1000000 DNA kahjustamise sündmust, mis üldjuhul kõik ära parandatakse. Peamised DNA kahjustuste põhjustajd on: Oksütatiivne stress. Seda põhjustavad keemiliselt aktiivsed ja ebastabiilsed hapnikuühendid (ROS - reactive oxygen species), mis tekivad erinevate metaboolste protsesside vaheproduktidena. Üldiselt on rakkudes süsteemid, mille ülesandeks on nende vaheühendite lagundamine ja neutraliseerimine, aga sellele vaatamata pääsevad mõned DNA-d kahjustama. ROS-id võivad oksüdeerida DNA aluseid [tekitada näiteks 8-oksü-7,8-dihüdroguaniini(8-oxoG)] või siis põhjustada üheahelalisi katkeid DNA-s. UV kiirgus, mis põhjustab ristsidemeid (crosslinks) DNA ahelas kõrvutiasetsevate pürimidiinide vahel. Selle tulemusks on 6-4 fotoproduktide (6-4 PP; 6-4 photoproduct) ja CPD (cyclobutane pyrimidine dimer) teke. CPD-st esineb kõige sagedamini T-T dimeere.

3. DNA reparatsioon. DNA kahjustuste allikad. Ioniseeriv kiirgus (näiteks g-kiirgus) põhjustab DNA kaheahelalisi katkeid. Ainuüksi loodusliku radioaktiivsuse fooni tõttu saab meie keha iga päev umbes 200 miljonit korda kiiritada. DNA aluste hüdrolüüs ja kõrgendatud temperatuur viivad DNA aluste eemaldamiseni (depurination, depyrimidination) või nende keemiliste omaduste muutuseni (deamination). Kokkupuutumine erinevate kemikaalidega, mis modifitseerivad nukleotiide või seonduvad DNA-ga ning indutseerivad katkeid või ristsidemeid DNA ahelates. Siia kuuluvad ka paljud (vähi)ravimid. Vead DNA replikatsioonis. Kõik DNA polümeraasid teevad vigu, mille nad küll tavaliselt ise ära parandavad, kuid osad jäävad need siiski alles ning tekitavad olukorra, kus DNA erinevatel ahelatel on omavahel mittepaarduvad nukleotiidid.

4. DNA reparatsioonisüsteemid. DNA-d vigastuste eemaldamiseks on rakkudes olemas mitmeid erinevaid reparatsioonisüsteeme, mis on võimelised üksteist osaliselt asendama. Otsesed pöördreaktsioonid (direct reversal) on väga kitsalt spetsialiseerunud mõnede konkreetsete kahjustuste eemaldamiseks. Näiteks saab T-T dimeere (ja ka teisi CPD-e ning 6-4 fotoprodukte) parandada spetsiaalsete ensüümide, fotolüaaside, abiga. Fotolüaas parandab UV kiirgusest põhjustatud vigastusi ning ensüüm ise vajab oma tööks (nähtava) valguse energiat. Fotolüaasi on leitud bakteritest, pärmidest, Drosophila’st, Xenopus’est, kuid mitte imetajatest. Samuti on võimalik otsese pöördreaktsiooniga parandada näiteks guaniinialuste metüleerimist. Seda tehakse metüülguaniini metüültransferaasi abiga, kuid selle reaktsiooni tulemusena valk inaktiveerub, seega saab ühe metüülguaniini metüültransferaasiga parandada ühe metüülguaniini. O6-metüülguaniin on aga väga ohtlik modifikatsioon, kuna selline nukleotiid võib edukalt paarduda nii C kui T nukleotiidiga, mistõttu selline metüleerumine ei tekita DNA ahelas erilist probleemi, kuid replikatsiooni käigus lülitab DNA polümeraas vastasahelasse T ning sellega ongi tekitatud mutatsioon.

5. Fotolüaas Miks imetajatel pole fotolüaasi? Võimalik, et see läks evolutsiooni käigus kaotsi ajal, kui dinosaurused valitsesid maailma. Imetajad olid siis juba olemas, aga nad olid pisikesed tähtsusetud öise eluviisiga olevused, kes päikesevalguse kätte sattusid harva...

6. DNA reparatsioonisüsteemid. DNA ühel ahelal olevate vigastuste parandamiseks on kolm peamist süsteemi: Base excision repair (BER), mille käigus eemaldatakse DNA ahelast üksik kahjustatud nukleotiid mis asendatakse uuega. BER-i kasutatakse peamiselt oksüdeeritud, alküleeritud, hüdrolüüsitud ja deamineeritud nukleotiidide väljavahetamiseks. Nucleotide excision repair (NER), mille käigus asendatakse DNA kahjustuse ümbrusest umbes 30 nukleotiidi pikkune üheahelaline DNA lõik. NER tunneb ära vigastusi, mis tekitavad suuremaid muudatusi DNA üldises struktuuris. Sellisteks on näiteks tümiini dimeerid ja DNA üheahelalised katked. NER jaotub kaheks alaliigiks: 1) transcription-coupled repair (TCR), mis aktiveerub, kui RNA polümeraas “avastab” DNA kahjustuse ning jääb seetõttu transkribeeritavale alale seisma. TCR tagab transkribeeritava DNA ahela kiire parandamise. 2) global genome repair (GGR), mis toimub transkriptsioonist sõltumatult ning on mõnevõrra aeglasem kui TCR. GGR parandab ka näiteks vigastusi transkribeeritava geeni mittekodeerivas DNA ahelas. Mismatch repair (MMR) kõrvaldab vigastused, mis on tekkinud DNA replikatsiooni või rekombinatsiooni käigus. Nendel juhtudel pole kumbki DNA ahel otseselt vigane, kuid nad ei paardu omavahel.

7. DNA reparatsioonisüsteemid. DNA kaheahelalisi katkeid parandatake kahel erineval viisil: Mitte-homoloogne DNA otsade ühendamine - NHEJ (non-homologous end joining), mille käigus DNA ligaas ühendab katkenud ahelad. NHEJ võib olla suhteliselt korrektne juhul, kui katkenud DNA ahelate otsad omavad kasvõi lühikest üheahelalist homoloogiat (mis saab tekkida siis, kui mõlemad ahelad ei katke täpselt samast kohast). Reeglina aga tekitab NHEJ mutatsioone, eriti väiksemate DNA lõikude deletsioone. Raku seisukohalt on see siiski parem variant kui jätta DNA ahelate otsad üldse ühendamata. Homoloogne rekombinatsioon – HR (homologous recombination) on parim viis kaheahelaliste katkete parandamiseks. HR-i puhul taastatakse katkenud koht homoloogse kromosoomi või tütarkromatiidi abil: puuduv DNA osa kopeeritakse vigastamata kromosoomi pealt. HR-i puhul taastatakse vigastatud koht täielikult ja ilma mutatsioonideta. HR on oluline reparatsioonisüsteem rakutsükli S ja G2 faasis, kuid G1 faasis toimub sagedamini NHEJ.

8. DNA reparatsioonisüsteemid.

9. Base excision repair (BER) BER-i esimeses etapis toimub vigastuse äratundmine erinevate DNA glükosülaaside poolt ning vigastatud nukleotiidi aluse äralõikamine. Selle tulemusena jääb DNA ahelasse ilma ühegi alusjäägita nukleotiid (abasic site). Järgmine etapp on DNA ahela lõikamine “tühja” nukleotiidi juurest APE1 endonukleaasi poolt.

10. Base excision repair (BER) Edasi võib asi minna kas mööda pikka või lühikest rada. Lühikeses variandis järgneb tekkinud ühenukleotiidise augu täitmine DNA polümeraas b poolt, millele järgneb DNA otste ligeerimine ligaas III poolt. Pikas variandis sünteesitakse 2-6 nukleotiidi ulatuses uut DNA-d, vana DNA üleliigne osa lõigatakse ära FEN1 endonukleaasi poolt ning DNA ligeeritakse ligaas I poolt

11. Nucleotide excision repair (NER) NER jaotub kaheks: GGR ja TCR, erinevus seisneb selles kuidas DNA vigastus avastatakse. TCR puhul on oluline RNA polümeraas II ja tema elongatsioonifaktor CSB. GGR puhul tuntakse DNA vigastus ära XPE (DDB2) ning XPC-hHR23B valgukompleksi poolt.

12. Nucleotide excision repair (NER) Järgmiseks etapiks nii GGR kui ka TCR rajas on TFIIH kohaletoomine. TFIIH on muuhulgas ka DNA helikaas (subühikud XPB ja XPD) ning nende abil toimub vigastatud kohas DNA ahelate avamine. Sellist avatud kompleksi stabiliseerivad XPA (kontrollib, kas tegu on ikka DNA kahjustusega) ja RPA (seondub üheahelalise DNA-ga). Kui XPA ei seondu, siis NER-i rada edasi ei lähe. Järgneb umbes 30 nukleotiidi pikkuse DNA tüki väljalõikamine endonukleaaside XPG ja XPF-ERCC1 poolt. Tekkinud “auk” sünteesitakse täis DNA polümeraaside d ja e poolt, vajalikud on ka RPA, RPC ja PCNA. TCR-i puhul seonduvad seisma jäänud RNA polümeraasiga CSB ning CSA-Cul4A-CSN kompleks. Need faktorid on olulised TFIIH kohaletoomiseks ning lisaks on CSA-Cul4A-CSN kompleks vajalik võimalikuks RNA polümeraasi lagundamiseks. CSB on ka RNA polümeraasi elongatsioonifaktor ning algatuseks püüab ta aidata seisma jäänud polümeraasil transkriptsiooni jätkata. Kui see ei õnnestu, siis aktiveeritakse TCR.

14. Mismatch repair (MMR) MMR on vajalik DNA replikatsioonil tekkinud mittepaarduvate aluspaaride korrigeerimiseks. MMR parandab DNA polümeraasi vead ning tõstab replikatsiooni täpsust 100-1000 korda. DNA paardumise vigu otsivad hMSH2/6 ja hMSH2/3 valgukompleksid (human MutS homolog). Leidnud vea, moodustavad hMSH2/6 valgud suletud kompleksi, neile seonduvad omakorda hMLH1 ja hPMS2. See kompleks hakkab mööda DNA-d edasi liikuma kuni jõuab järele DNA polümeraasile, eemaldab selle DNA-lt ning toob kohale eksonukleaas I (Exo I), mis lagundab sünteesitud ahela valesti paardunud kohani. Ilma abifaktoriteta on Exo I 5’->3’ nukleaas, kuid koos PCNA ja RFC-ga muutub ta 3’->5’ eksonukleaasiks. Jõudnud valesti paardunud kohani, alustatakse uuesti DNA sünteesi.

15. NHEJ (non-homologous end joining) NHEJ on levinud DNA reparatsioonisüsteem kõrgemates eukarüootides. See süsteem on küll kõikidest võimalikest kõige ebatäpsem ja põhjustab tavaliselt lühikesi deletsioone, kuid üldjuhul on see parim mida teha saab. DNA reparatsioon homoloogse rekombinatsiooni abil toimub põhiliselt S ja G2 faasis kui tütarkromatiidid on füüsiliselt üksteise lähedal ning seetõttu pole homoloogse ala leidmine keeruline. Põhimõtteliselt oleks HR teostamine võimalik ka G1 faasis kasutades homoloogset kromosoomi, kuid ruumiliselt võivad need paikneda väga erinevates piirkondades. Lisaks moodustavad erinevad kordusjärjestused näiteks inimese genoomist umbes 40%, mistõttu homoloogse kromosoomi identifitseerimine võib olla väga keeruline. Kordusjärjestuste olemasolu ongi peamine, kui mitte ainus, oluline põhjus miks rakud parandavad kaheahelalisi DNA katkeid NHEJ abil, riskides seejuures geneetilise info muutumisega. NHEJ toimumiseks on vajalik, et katkenud DNA otsad oleksid üksteise lähedal, kuigi pole teada, kuidas see saavutatakse (seda võivad teha nukleosoomid). Katkenud DNA otsi tunneb ära kahest valgust koosnev kompleks Ku. Ku subühikuteks on Ku70 ja Ku80 (mida tuntakse ka nime all Ku86 ja mille tegelik molekulmass on hoopis 83 kD). Ku kompleksi sees on “auk”, millesse mahub täpselt dsDNA. Kui Ku panna DNA rõngasmolekuli peale, siis ta ei saa sealt enam kunagi maha.

16. NHEJ (non-homologous end joining) Järgmisena seondub DNA otstega DNA-PK (DNA sõltuv proteiinkinaas). Ku on selle interaktsiooni soodustaja, kuigi DNA-PK seonduks DNA otsega ka ilma Ku abita. DNA-PK ja Ku interaktsioonid võivad samuti hoida katkenud DNA otsi üksteise ligidal. DNA-PK fosforüleerib mitmeid reparatsiooniks vajalikke valke, sealjuures iseennast. DNA-PK soendub ka nukleaasiga ARTEMIS (pärmis MRX kompleks), mis on vajalik DNA otstest mõnede nukleotiidide eemaldamiseks ning DNA otstes lokaalse homoloogia leidmiseks. Samuti seondub DNA-PK-Ku XRCC4-ligaas IV kompleksiga, mis ühendab vabad DNA otsad.

17. Homologous recombination (HR) DNA reparatsioon homoloogse rekombinatsiooni abil tagab korrektse dsDNA katkete parandamise. Selle käigus ei lähe midagi kaotsi, kuid võib toimuda cross-over tütarkromatiidide vahel. DNA katkestus tuntakse ära MRX (Mre11-Rad50-Nbc1) kompleksi poolt, mis on nukleaas ning lagundab ühe DNA ahela nii, et jääb alles 3’ otsaga üheahelaline DNA. Sellega seonduvad RPA, Rad51 ja Rad52. Vaba 3’ ots kaetakse Rad51 valkudega ning selline ssDNA-Rad51 filament hakkab otsima homoloogset dsDNA-d vigastamata kromatiidil. Järgneb ahela invasioon ning “hübriid-DNA” moodustamine. Selleks on vaja veel terve hulk Rad valke (Rad54, 57, 59 pärmis ning BRCA1, BRCA2, XRCC2 ja XRCC3 imetajates). Siis toimub puuduvate lõikude süntees ning DNA otste ligeerimine ning lõpuks tuleb kromatiidid taas lahutada.

18. Holliday junction Holliday ühendusi võib lahti lõigata kahel viisil, ühel juhul toimub cross-over, teisel juhul mitte.

19. DNA reparatsiooniga seotud haigused Xeroderma pigmentosum on geneetiline haigus, mille puhul esinevad mutatsioonid NER-iks vajalikes geenides. Selle tulemusena ei suuda rakud eemaldada peamiselt UV kiirgusest tulenevaid DNA vigastusi. XP patsiendid on ülitundlikud UV kiirguse suhtes, päikesepaiste põhjustab tõsiseid põletusi ning sellisetel inimestel on väga suur soodumus nahavähi tekkeks. Cockayne sündroomi patsientidel on defektne TCR rada, mutatsioonid on geenides CSA või CSB. Haigust iseloomustavad närvisüsteemi alaareng, UV tundlikus ning kiire vananemine. Tay sündroomi (trichothiodystrophy) iseloomustavad naha, küünte ja juuste ebanormaalne areng, vaimne ja füüsiline alaareng.

20. DNA reparatsiooniga seotud haigused Werneri sündroomi iseloomustab kiire vananemine. WS on haruldane haigus ning on levinud peamiselt Jaapanis. Selle haigusega inimesed kasvavad ja arenevad normaalselt kuni puberteedieani, kuid peale seda algab kiire vananemine. Enamsti ei ela WS patsiendid vanemaks kui 40-50 aastat, surres tavaliselt vähki või südmehaigustesse. Haigust põhjustab mutatsioon WRN geenis, mis on tõenäoliselt vajalik Holliday ühenduste avamiseks. Ataxia telangiectasia on haruldane neurodegeneratiivne haigus mida iseloomustavad näiteks kõndimishäired. AT patsientidel on kõrge soodumus vähkkasvajate tekkeks ning nende eluiga ei ületa reeglina 20 aastat. Haigust põhjustab mutatsioon geenis ATM, mis on oluline dsDNA katkete äratundmises ning rakutsükli kontrollimisel DNA katkete korral.