BIOCHEMICKÉ METODY IZOLACE A CHARAKTERIZACE PROTEINŮ

1. BIOCHEMICKÉ METODY IZOLACE A CHARAKTERIZACE PROTEINŮ Jana Novotná

2. Charakterizace proteinu • Molekulová hmotnost celého proteinu • Molekulová hmotnost polypeptidových řetězců • Určení primární struktury • Aminokyselinové složení • Aminokyselinové sekvence • Trojrozměrná struktura • Izoelektrický bod proteinu • Spektroskopické vlastnosti

3. Separační metody • Separace založené na velikosti molekul • (dialýza a ultrafiltrace, centrifugace v hustotním gradientu, gelová filtrační chromatografie) • B. Separace založené na rozdílech rozpustnosti proteinů • (izoelektrická precipitace, vysolování neutrálními solemi, frakcionace organickými rozpouštědly) • C. Separace založené na základě elektrického náboje • (elektroforetické metody, iontově výměnná chromatografie, afinitní chromatografie)

4. Separační metody A. Separace založené na velikosti molekul Dialýza a ultrafiltrace • Koncentrační gradient částic s povrchovým nábojem • Propustnost membrány pro rozpuštěné látky • Velikost povrchu membrány • Pohyb částic < 1000 Da

6. Centrifugace v hustotním gradientu • zkumavka je naplněná roztokem sacharózy s lineárně stoupající hustotou směrem ke dnu • hladina gradientového roztoku se převrství směsí proteinů • centrifugace za použití vysokých otáček, proteiny sedimentují určitou rychlostí podle velikosti, density a tvaru molekul (je dosažena rovnováha mezi hustotou roztoku a částicí) • po centrifugaci jsou proteiny v gradientu sacharózy rozděleny a zahuštěny Zóny obsahující zahuštěný protein

7. Gelová filtrační chromatografie (molekulová vylučovací chromatografie) • Hydrofilní gelové částice (polymer) • Uvnitř každé částice jsou póry • Látky se rozdělují podle velikosti (molekulové hmotnosti)

8. Optimální gel pro gelovou filtraci by měl mít následující vlastnosti: • inertní matrice gelu pro dělené složky i pro eluční roztoky. • chemicky stabilní gel během několika kroků, při různém pH a při různé teplotě. • mechanicky stabilní gel, aby se při větším tlaku nedeformoval. • velikost gelových částic nesmí být ani příliš malá (rozdělení je přesnější, ale pomalejší) ani příliš velká (rozdělení je rychlejší, ale může být nepřesné). Na rychlou chromatografii tedy použijeme gel s hrubšími zrny. Na vysoký stupeň rozlišení použijeme gel s malými zrny.

9. B. Separace založené na rozdílech rozpustnosti proteinů Izoelektrická precipitace • rozpustnost globulárních proteinů ovlivňuje pH • při pH = pI je rozpustnost nejnižší, molekuly mají tendenci se shlukovat – mají 0 náboj • protein má celkový povrchový náboj buď kladný nebo záporný • (NH3+ nebo COO- postranních řetězců aminokyselin v proteinu) • princip izoelektrické precipitace - každý protein má jiné pI a vysráží se ze směsi proteinů v roztoku, který má pH = jeho pI. pH roztoku je nižší pI pH roztoku je vyšší náboj proteinu náboj proteinu + -

10. Rozpustnost proteinu prudce stoupá je-liv pH nižším než pI proteinu nebo v pH vyšším než pI proteinu (molekuly mají stejné náboje a odpuzují se).

11. Vysolování neutrálními solemi Princip • Hydrofilní aminokyseliny interagují s molekulami vody a vytvářejí s ní vodíkové můstky • (čím více hydrofilních skupin, tím více je protein rozpustný) • Přidání soli do roztoku odebírá proteinu vodní plášť • Interakce protein/protein je silnější než protein/roztok • Molekuly proteinu koagulují díky hydrofóbním interakcím

12. Vyšší koncentrace neutrální soli (NaCl, KCl) ovlivňuje rozpustnost globulárních proteinů. • Povaha aniontu (Cl-) se ve vysolovacím efektu uplatňuje více než povaha kationtu Na+). • Dvojmocné a vícemocné anionty jsou účinnější než jednomocné anionty {MgCl2 a (NH4)SO4 více nežNaCl}. • Při vysoké iontové síle se protein kompletně vysráží(mezi 39 a 75 %).

13. Frakcionace organickými rozpouštědly • etanol sníží dielektrickou konstantu (nižší než voda) • sníží se stupeň ionizace a zvýší přitažlivé síly mezi opačnými náboji, tím se sníží rozpustnost. • udržování roztoku při teplotách kolem Oo C se snižuje nebezpečí denaturace proteinu.

14. C. Separace na základě elektrického náboje • Metody vycházejí z acidobazického chování proteinů (typ a počet ionizovatelných skupin aminokyselin) • Elektroforetické metody • Soubor separačních metod. • Využívají k dělení látek jejich odlišnou pohyblivost ve stejnosměrném elektrickém poli. • Na principu rozdílných elektroforetických mobilit se při elektroforéze dělí nabité molekuly (ionty): • při pH > pI - protein je aniontem, má celkový (-) náboj – pohyb k anodě • při pH < pI - protein je kationtem, má celkový (+) náboj – pohyb ke katodě

15. Zónová elektroforéza (dělení plasmatických bílkovin) • Proužek acetátcelulózy – nanesení vzorku. • Elektroforéza ( rozdělení podle různých elektroforetických pohyblivostí). • Rozdělené proteiny na zóny. • Densitogram • (densita je přímo úměrná koncentraci)

16. Iontově výměnná chromatografie Různá afinita dělených molekul k povrchu gelových částic s kovalentně vázanými částicemi s nábojem. Proteiny se váží díky elektrostatickým interakcím. Síla vazby závisí: a. celkovém povrchové náboji (funkce pH pufru a pI proteinu)

17. Substance používaná k dělení má upravený povrch zrn • (+) nabité gelové částice váží anionty • DEAE celulóza (diethylaminoethyl) • (-) nabité gelové částice váží kationty • CM celulóza (carboxymethyl) • navázané proteiny se z vazby uvolní změnou iontové síly • nebo změnou pH roztoku procházejícího chromatografickou kolonou

18. D. Separace pomocí specifického ligandu Afinitní chromatografie (adsorpční) Využití biologických vlastností proteinů - specifická nekovalentní vazba s jinou molekulou (ligand)

19. enzym + koenzym hormon + receptor antigen + protilátka inhibitor+substrát lektin+cukr použití nosiče - agarózové partikule (Sephadex)

20. Chromatografie na molekulovém sítu (gelová filtrace)

21. Určení molekulové hmotnosti z kalibrační křivky Kalibrační křivka Jednotlivé frakce proteinů se detekují spektrofotometrem. Rychlost průtoku proteinu je úměrná velikosti molekuly

22. Gelová elektroforéza • Gel zpolymerovaného akrylamidu (nebo agarózy). • Polymer vytváří síť (podle koncentrace akrylamidu určitá velikost ok sítě) • Molekuly se dělí podle své velkosti (malé rychleji, velké pomaleji). Detergent SDS (sodium dodecyl sulfate) přidaný do dělícího pufru dodá všem proteinům celkový záporný náboj. Všechny proteiny migrují jedním směrem - k anodě.

24. Děkuji za pozornost