1 / 119

Chromatografické metody

Chromatografické metody. Podstata. „Při chromatografii dochází k neustálému vytváření rovnovážných stavů separované látky mezi dvě fáze – stacionární a mobilní.“. Chromatografie. Mobilní fáze - kapalina – LC plyn – GC

nara
Download Presentation

Chromatografické metody

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Chromatografické metody

  2. Podstata „Při chromatografii dochází k neustálému vytváření rovnovážných stavů separované látky mezi dvě fáze – stacionární a mobilní.“

  3. Chromatografie • Mobilní fáze - kapalina – LC plyn – GC • Eluce - Izokratická – stejná eluční síla Gradientová – rostoucí eluční síla • Použití - analytická preparativní

  4. Kapalinová chromatografieLC| • Mobilní fáze - kapalina • Stacionární fáze - pevná fáze, kapalina

  5. Provedení LC • Papírová PC • Tenkovrstvá TLC • Kolonová CC

  6. Teoretické aspekty chromatografie

  7. Chromatografie

  8. Vr Vr’ Vm Chromatogram

  9. Retenční – eluční častr • Doba od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křuvky Retenční – eluční objemVr Objem mobilní fáze proteklý od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křuvky Fm – objemová rychlost mobilní fáze

  10. Mrtvý objem Vr – zdánlivý retenční objem Vr’- redukovaný (skutečný) retenční objem Vm- mrtvý objem – mimokolonové příspěvky + mimočásticový objem kolony

  11. Kapacitní faktor k’ k’= 1 – 10 Vs – objem stacionární fáze VM – objem mobilní fáze Distribuční koeficient cs – rovnovážná koncentrace látky ve stacionární fázi cM – rovnovážná koncentrace látky ve mobilní fázi

  12. ½Yr Yr Účinnost kolonypočet teoretických pater N

  13. Účinnost kolonyvýškový ekvivalent teoretického patra H l – délka kolony

  14. Účinnost kolony

  15. Rozlišení tr1 tr1 R12=1.5 – nulové překrytí R12=1.0 – překrytí 2 % Yr1 Yr2 Yr1 Yr2

  16. Síly a efekty využívané při separaci • Iontové síly • Polární síly • Nepolární síly • Sterické interakce • Efekt velikosti molekul

  17. Rozdělovací chromatografie

  18. cS cM Rozdělovací chromatografie Použití – analytická PC, TLC

  19. Adsorpční chromatografie

  20. cS cM Adsorpční chromatografie

  21. Adsorpční chromatografie • Stacionární fáze – polární Silikagel SiO2 . n H2O Oxid hlinitý Al2O3, AlO(OH), Al(OH)3 Hydroxyapatit [Ca5(PO4)3OH]

  22. Adsorpční chromatografie • Mobilní fáze – nepolární • Eluce - zvyšováním polarity mobilní fáze Eluotropická řada: uhlovodíky<subst.uhlovodíky<ketony< aldehydy<alkoholy<voda

  23. Reverzně fázová chromatografie • Stacionární fáze – nepolární C8,C18 • Mobilní fáze – polární – vodné roztoky pH  potlačit disociaci • Eluce – snižováním polarity mobilní fáze ACN, MetOH,

  24. Reverzně fázová chromatografie H2O Kartáčový typ stacionární fáze Použití : analytické – až 90 % analýz

  25. Iontově párová chromatografie analyt iontově párující činidlo + - SDS, HClO4 - - tetrabutylamonium

  26. sorbent C18 iontový pár Iontově párová chromatografie Stacionární, mobilní faze, eluce – RPC pH  plná ionizace analytu

  27. Hydrofobní chromatografie • Stacionární fáze – - C8,-fenyl • Mobilní fáze – vodné roztoky 1.7 M (NH4)2SO4 • Eluce – snižováním iontové síly Použití : purifikace bílkovin

  28. Ionexová chromatografie

  29. Ionexová chromatografie elektrostatická interakce Vazba + + Eluce +

  30. Ionexy • Katexy - - vazba kationtů silné - sulfo(S), sulfopropyl(SP) OSO3- slabé - karboxy(C), karboxymetyl(CM) COO- • Anexy - + vazba aniontů silné - dietylaminoetyl(DEAE) slabé – trietylaminoetyl(TEAE)

  31. Slabý ionex • Vykazuje změny vazebné kapacity v závislosti na pH • Má pufrační kapacitu COO- % COOH pH

  32. kapacita ionexu cS cM Ionexová chromatografie

  33. H3O+ H3O+ OH- OH- Donanův efekt zvyšování pH snižování pH

  34. Ionexová chromatografie • Nanášení vzorku – nízká iontová síla • Eluce – gradientová • Zvyšováním iontové síly • Změnou pH • Afinitní eluce Použití – purifikace, zakoncentrování, výměna pufru

  35. Chromatofokusaceděj na koloně pH = 9 pH = 4

  36. - + Chromatofokusacechování vzorku

  37. pI 9 pH 4 Chromatofokusacechování vzorku Použití : analytické – stanovení pI preparativní – purifikace bílkovin

  38. Afinitní chromatografie

  39. Afinitní interakce

  40. Interakce mezi DNA a endonukleasou

  41. Afinitní páry

  42. Afinitní chromatografienanesení vzorku

  43. Afinitní chromatografievznik interakce

  44. Afinitní chromatografievymytí balastů

  45. Afinitní chromatografieeluce

  46. Předpoklady pro vznik komplexu • Sterické – použití raménka (spacer) • Optimální pH, iontová síla

  47. Předpoklady pro vznik komplexu • Vazebné • Konformační

  48. Provedení • Nanesení vzorku – nízká iontová síla • Eluce – selektivní - volným ligandem – neselektivní - změna pH, iontové síly, polarity Použítí : analytické (stanoveni K), purifikace

  49. Gelová permeační chromatografie

  50. Gelová permeační chromatografie

More Related