Zebrafish as a model system

1. RNA or antisenseoligos microinjection Large clutches of embryos per mating, which aretransparent throughout external development In situ hybridization Organogenesis advenced in 24h Mutagenesis screeninig Rapiddevelopment Zebrafishas a model system

2. Analisi dell’espressione e della funzione del gene dinamina1 (dnm1) durante lo sviluppo embrionale di zebrafish (Danio rerio)

3. Endocitosi • Processo cellulare che permette alle cellule di assumere molecole di diversa natura dall’ambiente esterno, mediante movimenti della membrana • può essere costitutiva o regolata da stimoli esterni (ligandi, virus….) • classificazione sulla base della dimensione delle vescicole endocitotiche, sulla natura delle molecole internalizzate (ligandi, recettori, lipidi) e sulle modalità di formazione delle vescicole

4. Endocitosi mediata da clatrina Modalità di trasporto vescicolare implicata nella comunicazione intercellulare, nel recupero dei neurotrasmettitori a livello del terminale pre-sinaptico, nell’internalizzazione di recettori, fattori di crescita, antigeni e nutrienti

5. Endocitosi mediata da clatrina In Drosophila melanogaster sono stati isolati mutanti temperatura sensibili del gene dnm1. A temperature non permissive si ha un fenotipo paralitico a causa del mancato recupero di neurotrasmettitori • Lo stimolo elettrico arriva al terminale sinaptico • Influsso di Ca2+ • esocitosi • endocitosi mediata da clatrina

6. La famiglia delle dinamine (dnm) • Invertebrati • Drosophila melanogaster (shibire) • C. elegans (dyn1) • Vertebrati • Mus musculus (dnm1, dnm2, dnm3) • Rattus norvegicus (dnm1, dnm2, dnm3) • Homo sapiens (dnm1, dnm2, dnm3)

11. 1188 bp ORF 5’UTR 3’UTR 2661 67 1532 Identificazione del gene dnm1 di zebrafish • Screening di database di sequenze EST di zebrafish STOP 1114 bp hdnm1 • 5’ RACE • Abbiamo ottenuto un clone di circa 2700 bp codificante per una proteina di 843 aminoacidi che presenta un’identità dell’80% con la proteina umana DNM1.

14. Geni dnm di zebrafish

16. 30s 3’UTR 5’UTR mRNA AUG AAAA 50s Il termine '''espressione genica''' indica il processo attraverso cui l'informazione contenuta in un gene viene convertita in una proteina nucleo proteina

17. Espressione genica • Equivalenza nucleare: i nuclei di tutte le cellule di un organismo hanno lo stesso contenuto in termini di geni • L’espressione di un gene può essere costitutiva o regolata nello spazio e nel tempo Cellula muscolare Cellula nervosa gene1 gene1 gene2 gene2 gene3 gene3 AAAA AAAA mRNA 1 mRNA 1 mRNA 2 mRNA 2 AAAA AAAA AAAA mRNA 3

18. RT-PCR ESTRAZIONE DELL’mRNA RETRO- TRASCRIZIONE cDNA1 cDNA2 cDNA1 cDNA2 PCR cDNA3

19. IBRIDAZIONE IN SITU

21. ANALISIFUNZIONALE ANALISI FUNZIONALE PER PERDITA DI FUNZIONE Si inietta uno specifico morfolino, un oligonucleotide antisenso che si appaia al trascritto del gene target bloccando la traduzione.

22. AUG AA ANALISIFUNZIONALE ANALISI FUNZIONALE PER GUADAGNO DI FUNZIONE RNA sintetizzato in vitro sulla regione codificante del gene d’interesse

23. pcs2+ vector

24. si testano diverse concentrazioni di morfolino o di RNA • vengono coiniettati traccianti vitali o RNA codificante per la proteina GFP allo scopo di verificare l’avvenuta iniezione • la microinezione viene eseguita nel tuorlo di embrioni fino allo stadio di 4 blastomeri • controlli: -embrioni non iniettati • -per morfolino si può usare morfolino STANDARD CONTROL allo scopo di dimostrare che i fenotipi osservati nei morfanti non siano dovuti alla microiniezione in sé.

25. Sinapsi neuromuscolare SNC SNC somite somite NT NT somite

26. (Panzer et al., 2005) Primary motor neuron axons CaP (pink), MiP (blue), and RoP (green) exit the spinal cord through the ventral root and extend along the common pathway to the choice point (asterisk) located at the horizontal myoseptum as shown in the left myotomal segment. At the choice point, axons pause and then proceed to innervate a cell-appropriate territory. At later time points, MiP retracts its ventral axon, the dorsal MiP and ventral CaP axons reach the edge of the myotome and turn laterally, and RoP elaborates an axonal arbor laterally near the horizontal myoseptum as shown in the right myotomal segment. Beginning ca. 5 h after primary motor axons pioneer the common pathway, secondary motor axons (dark blue) exit the spinal cord and extend into the periphery as shown in the right myotomal segment

28. A) defects in the activity of neuromuscolar synapses SNC C Motility defects Muscular defects somite SNC B) defects in the axons pathfinding C somite

30. Touch response defects • mutants with defects in the function of synaptic proteins involved in the control of synapse activity (acetylcholinesterase, acetylcholine receptor....) 2 mutants with defects in neuromuscular synaptogenesis Hp: the loss of function of zdnm1 could limit the formation or the activity of CNS synapses and neuromuscolar synapses.

31. synapse activity We are analysing by electron microscopy the central nervous system of morphants, focusing on the number of synapses and the ultrastructure of presynaptic terminal. PSD PSD ctrl dnm1-MO Lower Dnm1 protein level after zdnm1-MO microinjection could limit neurotransmitters uptake decreasing endocytosis at presynaptic level.

32. semi-thin sections (24 hpf, 48 hpf, 63 hpf, 90 hpf) thin sections (24 hpf, 48 hpf, 63 hpf, 90 hpf) histological and cytological analysis of somite structure

33. motility defects mutants with defects in the function of synaptic proteins involved in the control of synapse activity (acetylcholinesterase, acetylcholine receptor....) Defects in myofibrils organisation nerve input works to refine the parameters that determine functional specialisation of the muscle. Hp: the loss of function of zdnm1, could cause an impairment of nerve input that affects the myofibrils organisation

34. conclusions • zdnm1 presents a temporally and spatially regulated expression pattern during zebrafish central nervous system development. • the effects of zdnm1 knock down on motility and myofibrils organization in somite cells strongly suggest an important role of zDnm1 in formation and activity of neuromuscular synapses and synapses in central nervous system.

35. (Berghmans et al., 2005)

36. (Berghmans et al., 2005)

37. (Berghmans et al., 2005)

38. muscle cells development

39. 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ PCR 3’ • Metodica messa a punto da Kary Mullis (premio Nobel per la chimica,1993) • Permette di amplificare una SPECIFICA sequenza di DNA • Primer: oligonucleotidi con polarità 5’-3’ che fiancheggiano la sequenza che si vuole amplificare. Servono da innesco per la reazione di polimerizzazione catalizzata dalla Taq polimerasi • Taq polimerasi: DNA polimerasi resistente al calore 5’

40. RT-PCR Retrotrascrizione PCR