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Concetti addizionali: come controllare gli attivatori?. Espressione tessuto-specifica o inducibile di fattori di trascrizione costitutivamente attivi Attivazione post-traduzionale di fattori inattivi (es. tramite fosforilazione)
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Concetti addizionali: come controllare gli attivatori? • Espressione tessuto-specifica o inducibile di fattori di trascrizione costitutivamente attivi • Attivazione post-traduzionale di fattori inattivi (es. tramite fosforilazione) • Regolazione della localizzazione cellulare (e.s sequestramento nel citoplasma) • Attivazione mediata da ligando (es. ormoni steroidei)
Attivazione/repressione trascrizionale a lungo raggio: • Le regioni di controllo di un locus (Locus Control Regions – LCR) • Le regioni di attacco alla matrice nucleare (MAR) • Gli isolatori
Attivazione/repressione trascrizionale a lungo raggio: • Regioni cromosomali trascrizionalmente attive (eucromatina) • Regioni cromosomali trascrizionalmente inattive (eterocromatina) • Fenomeno del silenziamento posizionale o eterocromatizzazione
Lo sviluppo di neoplasie comporta sempre anomalie nell’espressione genica:
Fattori di trascrizione come oncogeni. Esempio: attivazione inserzionale c) Attivazione tramite traslocazione nel gene della catena pesante delle Ig – t(8;14) -> LINFOMA DI BURKITT
Fattori trascrizionali come soppressori di tumore. Esempio: p53 • La stabilizzazione di p53 causata da danno al DNA induce l’espressione di • p21, un inibitore delle cinasi ciclina-dipendenti • l’ inibizione dell’attivita’ cinasica delle cicline Cdk1, 2, 4 e 6 provoca arresto del • ciclo cellulare
L’assenza di CBP nel topo causa lo sviluppo di tumori ematologici • (simile alla sindrome Rubinstein-Taybi, associata all’inattivazione dell’attivita’ • enzimatica di CBP) • Possibile meccanismo: ridotta attivita’ di p53
Gli oncogeni virali SV40 large T e E1A dell’adenovirus bloccano CBP e necessitano di questa attivita’ per trasformare le cellule: coinvolgimento di p53?
Il virus oncogeno HTLV-1 necessita di CBP per attivare la trascrizione del suo genoma:
Acetilazione aberrante nel cancro:coinvolgimento sia di HAT che di HDAC HAT: • Geni codificanti per diverse HAT si trovano traslocati, amplificati, sovraespressi e/o mutati in diversi tipi di tumori, sia ematologici che epiteliali • Mutazioni missenso o associate a p300 tronca NON FUNZIONALE si trovano associate a tumori del colon/retto e gastrici (secondo allele deletato) • Gli individui con sindrome di Rubinstein-Taybi portano una mutazione che inattiva l’attività HAT di CBP -> aumentato rischio di tumori • L’80% dei glioblastomi mostra associazione con perdita di eterozigosi per p300 • perdita di eterozigosi attorno al locus di CBP è associata a carcinomi epatocellulari. • Traslocazioni di p300 e CBP risultanti in fusioni in frame con diversi geni -> associate a diversi tumori ematologici
HDAC e cancro HDAC: • Leucemia acuta promielocitica (APL): PML-RARa, l’oncoproteina generata da una fusione per traslocazione cromosomica, reprime i geni normalmente attivati da RARa mediante reclutamento di un co-repressore contenente attività HDAC • Linfoma non-Hodgkin: il repressore trascrizionale LAZ3 è anormalmente sovraespresso e causa repressione trascrizionale aberrante (HDAC dipendente) con conseguente trasformazione tumorale • La leucemia acuta mieloide M2 è associata con t(8;21) che genera una proteina di fusione AML1/ETO che agisce come un potente repressore trascrizionale dominante tramite reclutamento di HDAC
Uno squilibrio nell’acetilazione degli istoni può quindi causare alterazioni della struttura della cromatina e regolazione aberrante di geni coinvolti nel controllo del ciclo cellulare, del differenziamento e/o dell’apoptosi
Inibitori delle HDAC: una nuova terapia anti-cancro • Diverse sostanze che causano differenziamento, arresto della crescita e/o apoptosi di cellule trasformate -> inibitori di HDAC (es. DMSO, Tricostatina A (TSA), butirrato) • Questi inibitori causano arresto del ciclo cellulare in G1 o G2, differenziamento e/o apoptosi in vitro, documentati in tutti i tipi cellulari trasformati incluse linee cellulari derivate sia da tumori ematologici (leucemie, linfomi, mielomi) che epiteliali (tumore dei polmoni, delle ovaie, del seno, della prostata) • Le concentrazioni biologicamente attive correlano con quelle richieste per causare accumulazione di istoni acetilati
SI IGNORA quali siano gli HDAC la cui attività deve essere bloccata • Gli inibitori causano aumento dell’ acetilazione sugli istoni (H2A, H2B, H3 e H4) anche in cellule normali, ma l’attività di soppressione della crescita sembra essere limitata alle cellule trasformate. • Geni bersaglio: • CDKN1A (codificante per l’inibitore dell’attività cinasica ciclina-dipendente p21/WAF1) (tramite un sito di SP1 sul promotore) • CDKN2A (p16) • Ciclina E
Altro meccanismo per reprimere la trascrizione: la metilazione del DNA • La metilazione nei vertebrati avviene esclusivamente sui residui di C nel dinucleotide CpG • Le sequenze CpG sono sotto-rappresentate nel genoma (probabilmente per la tendenza della 5-metilcitosina a venire deaminata e mutata in T) -> ma abbondanti nelle regioni promotrici dei geni • In cellule non embrionali, 80% dei CpG sono metilati, ad eccezione delle isole CpG dei promotori • Le DNA metil-transferasi (Dnmt) hanno particolare affinità per le sequenze semi-metilate: tendono quindi a metilare il nuovo filamento che si è formato su uno stampo metilato-> mantenimento del pattern di metilazione
La metilazione è regolata durante lo sviluppo: • Il DNA viene ipermetilato nei gameti • Demetilato durante le prime divisioni cellulari • Successivamente rimetilato in modo specifico per i diversi tipi cellulari (modificazione epigenetica)
Funzioni della metilazione: • Difesa contro i trasposoni • Regolazione genica
Metilazione e regolazione genica: • Dnmt metilano il DNA • Il DNA metilato è legato da proteine che legano il metile (MeCP2, MBD1-4) • Queste a loro volta sono in grado di reclutare diversi HDAC -> repressione della trascrizione • Il pattern di metilazione dei geni è alterato nelle cellule tumorali, e metilazione alle isole CpG di certi geni è associata al loro silenziamento specifico (es. PML-RAR lega il promotore del gene RARb e causa il reclutamento di DNMT -> metilazione -> MBD -> HDAC)
La metilazione è il meccanismo su cui si basa l’imprinting
Modificazioni epigenetiche, trascrizione e ambiente • In quanto reversibili, i cambiamenti epigenetici possono essere modificati dall’ambiente • Sia ipo- che iper-metilazione sono stati associati all’invecchiamento (perdita generica di metilazione, ipermetilazione di geni specifici: silenziamento di soppressori tumorali?) • Vitamine quali l’acido folico, che sono importanti per l’attività degli enzimi che forniscono gruppi metilici, hanno effetti notevoli sull’incidenza di tumori quali in cancro al colon • Dieta scarsa in folati -> instabilità genomica e ipometilazione • Dieta scarsa di gruppi metilici -> cancro del fegato, e ipometilazione+sovraespressione di oncogeni (c-ras, c-myc, c-fos)
Cooperatività tra inibitori di HDAC e di DNMT • 5-aza-2’-desossicitidina (inibitore di DNMT1) -> ipometilazione e riattivazione di soppressori di tumori silenziati • Può cooperare con inibitori dele HDAC quali TSA • Con potenziale riduzione delle dosi richieste e della tossicità, e minori possibilità di insorgenza di meccanismi di resistenza