Renato Santana de Aguiar Orientadora: Profa. Andréa Mara Macedo

1. Influência da espécie de triatomíneo na seleção de subpopulações em infecções mistas de Trypanosoma cruzi Renato Santana de Aguiar Orientadora: Profa. Andréa Mara Macedo Co-orientador: Prof. Sérgio Danilo Pena Colaboração: Prof. Egler Chiari Laboratório de Genética Bioquímica Laboratório de Biologia do Trypanosoma cruzi

2. A DESCOBERTA Flagelados sangüíneos 1909 P. megistus

3. PREVALÊNCIA E TRANSMISSÃO Modos de Transmissão • Vetorial: 80% • Transfusional: 17% • Congênita: 2% • Outros: 1%

4. ? INFECÇÃO HUMANA FASE AGUDA Sinal de Romanã FASE CRÔNICA Cardíaca Digestiva Indeterminada

5. A doença de Chagas Fase crônica:  indeterminada cardíaca digestiva cardio-digestiva indeterminada cardíaca digestiva cardio-digestiva Dias, 1985

6. Ciclos de transmissão Ciclo doméstico Ciclo silvestre

7. Vetores e reservatórios Principais vetores • Triatoma infestans • Triatoma brasiliensis • Panstrongylus megistus • Triatoma pseudomaculata • Triatoma sordida Principais reservatórios • marsupiais • desdentados • roedores • carnívoros • lagomorfos • primatas

8. Variedade Populacional de T. cruzi Biológica Morfologia Virulência/patogenicidade Cinética de crescimento Susceptibilidade à drogas Constituição antigênica Propriedades imunológicas Infectividade em céls. hospd. 1909

9. Gambás e triatomíneos silvestres Z1 Z2  Z3 Isoenzimas Protéico Humanos Amazônia Esquizodema kDNA Grupo 1 - ciclo doméstico Grupo 2 - ciclo silvestre rRNA Mini-exon DNA nuclear

10. Simpósio Internacional Comemorativo dos 90 anos da Descoberta da Doença de Chagas Rio de Janeiro, 1999 Zimodema 1 (Miles e cols., 1977) Ribodemas II/III (Clark & Pung, 1994) Grupo 2 do rRNA (Souto e cols., 1996) T. cruzi I T. cruzi II T. cruzi Zimodema 2 (Miles e cols., 1977) Ribodemas I (Clark & Pung, 1994) Grupo 1 do rRNA (Souto e cols., 1996) Cepas sem caracterização ou inconclusivas

11. A doença de Chagas

12. ? ISOLAMENTO E MANUTENÇÃO DE PARASITAS in vitro PARASITAS PARA ANÁLISE MOLECULAR INFECÇÃO POLICLONAL REDUÇÃO POPULACIONAL

13. AT AT AT AT AT CA CA CA CA CCG CCG CCG CCG CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA Microssatélites de DNA Taxa de mutação: 10-3 a 10-5 Dispersos em todo o genoma Altamente polimórficos

14. CA CA CA CA CA CA Replicação do DNA GT GT GT GT GT GT CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT Alça na fita nascente Alça na fita molde GT Inserção Deleção

15. Microssatélites de repetição (CA)n no genoma de T. cruzi

16. Amplificação de microssatélites (PCR) alelo A alelo B alelo C AA AB AC BB BC CC

17. Avaliar a influência de espécies de triatomíneos provenientes de diferentes ecótopos na seleção de sub-populações em infecções mistas de T. cruzi, através da amplificação de microssatélites de DNA diretamente das fezes de triatomíneos infectados.

18. ESTABILIDADE DOS MICROSSATÉLITES

19. 10a geração 20a geração 30a geração 40a geração 50a geração 60a geração 70a geração Parental Amplificação por PCR Locos: SCLE10, SCLE11, MCLE01, MCL03, MCL05, MCLE08, MCLG10 e MCLF10 Cultivo de 70 gerações do clone CL Brener

20. PCR LASER Detecção de polimorfismos de microssatélites ALF

21. Eletrofluorograma das 70 gerações do clone CL Brener MCLG10 MCL05 parental parental 10a 10a 20a 20a 30a 30a 40a 40a 50a 50a 60a 60a 70a 70a

22. Estabilidade dos microssatélites de T. cruzi

23. Conclusões Os microssatélites de repetição (CA)n dos locos: SCLE10, SCLE11, MCLE01, MCL03, MCL05, MCLE08, MCLF10 e MCLG10 do clone CL Brener de T. cruzi não se alteraram nas 70 gerações avaliadas. Os microssatélites de repetição (CA)n do genoma de T. cruzi são altamente estáveis em condições laboratoriais, sendo portanto, bons marcadores genéticos a serem utilizados nas infecções experimentais em triatomíneos.

24. ESTUDOS POPULACIONAIS DE ISOLADOS NATURAIS DE T. cruzi

25. Humanos (6) Humanos (3) Triatomíneos (8) Gambá (2) Mico leão dourado (3) Gambá (1) Silvestres:14 Domésticos:14 Isolados naturais de T. cruzi Humanos (5)

26. SCLE10 SCLE11 MCLE01 MCLF10 MCLG10 Metodologia Locos de microssatélites amplificados Eletroforese em seqüenciador automático de DNA ALF

27. B C D A Perfis de amplificações MCLE01 A e B (200 pm e Ig 62 / humano)  monoclonais C e D ( RB VII, RB III / Rhodnius brethesi)  multiclonais

28. Infecções mistas em triatomímeos

29. Cepas multiclonais RBII, RBIII, RBVII, RB VIII, RB X, JJ/AM e AM16 Coura e cols., 1994

30. LOCOS DE MICROSSATÉLITES CEPAS SCLE10 SCLE11 MCLE01 MCLF10 MCLG10 pb

31. Caracterização da região 3’ do gene 24S rRNA Gene rRNA 24Sa 5’ 3’ A B C 125 bp - 110 bp - Grupo 1 Grupo 1/2 Grupo 2

32. RBIX RBVI 1502 D7 GLT600 100 RBI 1523 Rede de Wagner Método da Máxima Parcimônia 100 20 cepas de T. cruzi 84Ti CPI 95/94 93 1931 GLT564 LEGENDA 81 200pm GLT593 803 Grupo 2 rRNA 24S Ig62 CPI 103894 Grupo 1 rRNA 24S Ig539 CPI 11/94 95 OPS 27/94 PFPI 58/94 1 1 1

33. Evidências da clonalidade de T. cruzi Cálculo da heterozigosidade (GENETIX, H = 1 - Xi2) Desvio de equilíbrio de Hardy-Weinberg

34. Conclusões Os microsstélites de repetição (CA)n são ferramentas poderosas na avaliação da clonalidade de uma cepa de T. cruzi. Os maiores índices de infecções mistas foram encontrados em isolados naturais de triatomíneos silvestres. A maioria dos isolados naturais de pacientes chagásicos são constituídos de apenas uma população de T. cruzi.

35. Conclusões Os microssatélites foram capazes de separar os isolados naturais de T. cruzi em dois grupos, fortemente correlacionados com as tipagens realizadas pelo gene do rRNA. A separação entre os grupos de T. cruzi proposta pelos microssatélites pode ser também correlacionada com os ciclos silvestre e doméstico dos parasitas, exceções feitas às amostras isoladas de primatas.

36. DESENVOLVIMENTO DE INFECÇÕES MISTAS DE T. cruzi EM TRIATOMÍNEOS

37. CL Brener 239 275 Col1.7G2 255 259 JG SCLE10 275 273 PNM 271 281 Mistura

38. Infecções experimentais em triatomíneos Dipetalogaster maximus Ninfas de 3° estágio

39. 67parasitas/ml de cada 200 parasitas/ml CL JG PNM CL JG PNM Alimentação de triatomíneos CL JG PNM CL +JG +PNM CL JG PNM Obtenção de tripomastigotas sangüíneas

40. Alimentação artificial dos triatomíneos A  parafilme B  recipiente para o sangue C  sangue D  câmara aquecida (37°C) E  conector do banho maria circulante

41. Coleta do contéudo intestinal dos triatomíneos Tempo de infecção 30 e 60 dias Extração de DNA total Proteinase K Guanidina 6M Lise Alcalina Fervura

42. Padronização da metodologia D. maximus infectados com CL Brener (60 dias de infecção) SCLE10

43. Infecções mistas de T. cruzi em triatomíneos de diferentes ecótopos Triatoma infestans (doméstico) Rhodnius neglectus (silvestre) X

44. Infecções em T. infestans CL Brener Col1.7G2 JG PNM Infecções isoladas 200 parasitas/ml CL Brener+Col1.7G2+PNM+JG 50 parasitas/ml por pop. 30 dias CL Brener+Col1.7G2+PNM+JG 50 parasitas/ml por pop. 60 dias Infecções mistas CL Brener+Col1.7G2+PNM+JG 200 parasitas/ml por pop. 60 dias

45. CL Brener Col1.7G2 PNM JG JG PNM Infecções isoladas em T. infestans - SCLE10 Col1.7G2 JG CL Brener Col1.7G2 PNM JG JG PNM

46. CL Brener Col1.7G2 PNM JG JG PNM Infecções isoladas em T. infestans - SCLE10 CL Brener PNM CL Brener Col1.7G2 PNM JG CL PNM

47. Infecções isoladas em T. infestans 110 100 90 80 70 fezes positivas 60 50 40 30 % de 20 10 0 JG CL Brener Col1.7G2 PNM Infecções realizadas Infecções isoladas em T. infestans SCLE10 200 parasitas/ml 60 dias

48. Infecções mistas em T. infestans C + Col1.7G2 PNM JG CL PNM CL Brener C - T. Infestans infectados CL Brener+Col1.7G2+PNM+JG 50 parasitas/ml 60 dias SCLE10 C +

49. Infecções mistas em T. infestans (CL Brener + Col1.7G2 + PNM + JG) 110 110 100 100 90 90 80 80 70 70 60 60 % de fezes positivas % de fezes positivas 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 0 0 CLBrener CLBrener JG JG Col1.7G2 Col1.7G2 PNM PNM Populações de Populações de T. T. cruzi cruzi detectadas detectadas Infecções mistas em T. infestans Protocolos de infecção 50 parasitas/ml por pop. 30 dias 50 parasitas/ml por pop. 60 dias 200 parasitas/ml por pop. 60 dias SCLE10

50. Infecções mistas em Infecções mistas em T. T. infestans infestans 110 110 100 100 90 90 80 80 70 70 60 60 % de fezes positivas % de fezes positivas 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 0 0 CL Brener PNM JG Col1.7G2 Populações de Populações de T. T. cruzi cruzi detectadas detectadas Ausência do clone CL Brener na infecção mista Protocolos de infecções CLBrener+Col1.7G2+PNM+JG Col1.7G2+PNM+JG 50 parasitas/ml por população 60 dias