Expression du G é nome

1. Expression du Génome Le transcriptome

2. Déchiffrage de l’Information Génique • L’information est encodée dans la séquence de nucléotides contenus dans des unités discrètes • Les gènes • L’information contenue dans les gènes est transcrite pour générer les ARNs puis décodée pour générer les protéines

3. Site d’initiation de la transcription Region 3’ nontraduite Region 5’ nontraduite Introns 5’ 3’ Int. 1 Int. 2 Exon 1 Exon 2 Exon 3 Promoteur/ Region régulatrice Séquence de terminaison Exons Transcrit d’ARN Les Gènes Seulement un des deux brins d’un gène est codant!

4. Codant • Brin Codant • Brin positif • Brin sens • Brin complémentaire à la matrice • Brin dont la séquence est la même que celle de l’ARN transcrit • Brin sur lequel se retrouve le promoteur 4

5. Non Codant • Brin non Codant • Brin négatif • Brin anti sens • Brin matrice • Brin dont la séquence est complémentaire à celle de l’ARN transcrit 5

6. 5’ TAG 3’ ADN: 3’ ATC 5’ Transcription 5’ ? 3’ ARN: Traduction Leu Protéine: Code génétique: CUA = Leu UAG = Arrêt Codant Vs Non-codant

7. Transcription Traduction Génome Transcriptome Répertoire d’ARN des gènes qui codent pour des protéines Répertoire d’ARN qui représente la fraction du génome qui est exprimée Protéome Répertoire de protéines dérivées du transcriptome

8. Un Génome • Le transcriptome est-il le même dans toutes les cellules d’un organisme? • Le transcriptome est-il toujours le même dans une cellule donnée?

9. Est-ce qu’une Séquence Code pour un Transcrit? • Analyse d’hybridations Northern :  • RT-PCR 

10. Comparaison des Méthodes Northern RT-PCR Séquence doit être connue Non Oui Présence ou absence d’un transcrit Oui Oui Permets de déterminer la taille Oui Non Sensibilité Faible Élevée Comparer l’abondance relative Oui Oui Obtenir la séquence du transcrit Non Oui Déterminer quel brin d’ADN est transcrit Oui Oui Déterminer combien de transcrits sont fait à partir d’une séquence Oui Non LA SÉQUENCE DOIT ÊTRE EXPRIMÉE OUI OUI

11. Analyse Northern • Isoler l’ARN total de cellules ou d’un tissu • Séparer les ARN d’après leurs grosseurs sur gel d’agarose dénaturant • Formaldéhyde + Formamide • Hybridation avec une sonde complémentaire ARNr ARNt

12. Hybridation Northern • Nécessite une sonde • Hybridation = la sonde possède des séquences d’un gène • La séquence est exprimée • Intensité du signal d’hybridation = abondance relative • Nombre de signaux d’hybridation = nombre de transcrit • Possiblement nombre de gènes

13. Hybridation Northern • Permet de comparer la quantité relative d’un transcrit • Sensibilité faible • Requiert un témoin interne • Gène dont l’abondance est constante sous les différentes conditions examinées • Témoin pour les variations de la quantité d’ARN chargé • Utilise des gènes domestiques : • Gènes qui assurent les fonctions indispensables à la vie de tous les types de cellules • Expression constitutive

14. La Normalisation

15. Tissus: F C R P Actine Fos Problème • Un Northern d’ARN isolé de différents tissus a été sondé avec le gène Fos et le gène domestique actine. Expliquer les résultats obtenus

16. RT-PCR • Permets d’amplifier une séquence d’ARN • Isoler l’ARN total de cellules ou d’un tissu • Transcrire les ARN en ADNc avec transcriptase inverse • Amplifier par PCR la séquence d’intérêt

17. AAAAAAA AAAAAAA ARNm AAAAAAA AAAAAAA AAAAAAA Appariement d’amorce polyT Transcription d’ADNc T.I. TTTT TTTT TTTT TTTT TTTT TTTT TTTT TTTT TTTT TTTT AAAAAAA AAAAAAA AAAAAAA AAAAAAA AAAAAAA AAAAAAA AAAAAAA AAAAAAA AAAAAAA AAAAAAA Réaction de Transcriptase InverseGène Non-Spécifique Collection d’ADN complémentaire aux ARNm exprimés à un temps donné sous une condition donnée

18. AAAAAAA AAAAAAA AAAAAAA AAAAAAA AAAAAAA Appariement d’une amorce gène spécifique AAAAAAA AAAAAAA Synthèse d’ADNc AAAAAAA AAAAAAA AAAAAAA AAAAAAA T.I. AAAAAAA AAAAAAA AAAAAAA AAAAAAA Réaction de Transcriptase InverseGène Spécifique ADN complémentaire à unARNm d’intérêt

19. Collection d’ADNc ADNc d’ARN d’intérêt PCR avec des amorces spécifiques à une séquence d’intérêt Analyse sur gel RT PCR

20. RT-PCR • La séquence doit être connue pour la conception d’amorces • Produit d’amplification = • Les séquences des amorces font partie d’un gène • La séquence est exprimée • Intensité du produit d’amplification = abondance relative • La taille du produit d’amplification n’est pas égale à la taille du transcrit