Genética Molecular 2010

1. Genética Molecular 2010 e-mail: genmol@gmail.com clave: cromatina Profesores: Dr. Víctor Romanowski Dr. Daniel Grasso Instructoras: Dra. Silvina Richard Dra. Patricia Agostino

2. “Dogma central de la biología molecular” replicación de DNA virus a DNA reparación recombinación DNA transcripción inversa retrovirus y retroelementos transcripción procesamiento de RNA splicing, edición, modificación de nucleótidos y de extremos 5´y 3´ RNA transcripción y replicación de RNA virus a RNA traducción plegamiento (folding), procesamiento, direccionamiento (targeting) proteína Víctor Romanowski

3. ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO Las primeras evidencias 1928: Frederick Griffith Infección con dos cepas de Streptococcus pneumoniae (S) Lisas (S): virulentas Rugosas (R): inofensivas (R) (S) inactivada Griffith showed that adding heat-killed virulent bacteria (harmless to mice) to a live nonvirulent strain permanently transformed the latter into lethal, virulent, encapsulated bacteria. (R) + (S) inactivada

4. El principio de transformación observado por Griffith era el DNA de la bacteria de la cepa S (virulenta). Si bien la bacteria había muerto, su DNA sobrevivió al proceso de alta temperatura y fue tomado por la bacteria R (inofensiva). EL DNA de la cepa S contiene los genes que forman la cápsula de protección de polisacárido. Equipado con este gen, la cepa de bacteria R estaba ahora provista de protección frente al sistema inmune del animal y por lo tanto podía matar al animal. La naturaleza exacta del principio de transformación de DNA fue verificada en los experimentos realizados por Avery, McLeod y McCarty, y por Hershey y Chase.

5. ¿Como se demostró que el DNA es el responsable de la herencia?

10. ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO El experimento de Avery O., McLeod C. y McCarty M. (1944) fue la primer evidencia directa de que el DNA es la base de la información genética Extract from heated smooth (S) bacteria treatment with protease (digests proteins) mix with rough (R) bacteria and injected into mice mice died Extract fromheated smooth (S) bacteria treatment with DNase (digests DNA) mix with rough (R) bacteria and injected into mice mice lived DNA carries genetic information

11. 35S experiment 32P experiment ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO Alfred Hershey y Martha Chase (1952) Determinaron que el DNA es el material genético en el bacteriófago T2

12. ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO La naturaleza química de los ácidos nucleicos Cuando se realiza la hidrólisis completa de los ácidos nucleicos, se obtienen tres tipos de componentes principales: • Azúcar: una pentosa. • Ácido fosfórico • Bases nitrogenadas: • purinas y pirimidinas

13. Cómposición química de los Ácidos nucleicos Bases nitrogenadas: púricas y pirimidínicas. A, G, T, C están presentes en el ADN A, G, U, C están presentes en el ARN

14. Cómposición química de los Ácidos nucleicos

15. Terminología: bases/ nucleósidos/ nucleótidos

16. Los nucleótidos se unen entre sí para formar largas cadenas de polinucleótidos, esta unión entre monómeros nucleótidos se realiza mediante enlacesfosfodiésterentre los carbonos de las posiciones 3’ de un nucleótido con la 5’ del siguiente ADN = DNA ARN = RNA

17. Conformación de un nucleótido: ángulos de torsión Grados de libertad Restricciones estéricas

18. Conformaciones adoptadas por los nucleósidos de purina y pirimidina

19. ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO La estructura del DNA REGLAS DE CHARGAFF (1940) La proporción de Adenina (A) es igual a la de Timina (T). %A=%T La proporción de Guanina (G) es igual a la de Citosina (C). %G = %C La composición de bases es la misma en distintos tejidos de una misma especie. La proporción de bases púricas (A+G) es igual a la de las bases pirimidínicas (T+C). (A+G)=(T + C) La proporción entre (A+T) y (G+C) es característica de cada organismo, pudiendo tomar por tanto, diferentes valores según la especie estudiada. La composición de bases varía de una especie a otra.

20. ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO % de bases en distintos organismos

22. ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO La estructura del DNA Patrón de difracción de rayos X Patrón helicoidal del DNA. (1953) Dos periodicidades a lo largo del eje, una primaria de 3,4 Å y una secundaria de 34 Å. "The instant I saw the picture my mouth fell open and my pulse began to race." -- James D. Watson (1968), The Double Helix, page 167. New York: Atheneum, Library of Congress card number 68-16217.

23. Avances científicos Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid James Watson & Francis Crick Nature, vol 171 (4356), 737-738 25 de abril de 1953

24. ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO A T G C Estructura del DNA: la doble hélice • El esqueleto hidrofìlico de grupos fosfato y deoxiribosa alternantes está expuesto al agua del ambiente • El anillo de furanosa está en la conformación C-2´endo • Las bases están apiladas en el interior de la doble hélice, con sus planos perpendiculares al eje de la doble hélice • En el equilibrio ceto-enol, las formas tautoméricas predominates de las bases son las ceto • (ceto : enol = 10.000 : 1) • El apareamiento de las dos cadenas genera un surco mayor y un surco menor en la superficie de la doble hélice Reglas de Chargraff: DNA doble cadena(dsDNA)

25. ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO La estructura del dsDNA

26. ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO interacciones que estabilizan la doble hélice • Enlaces de hidrógeno (pequeña contribución) • Apilamiento de bases e interacción hidrofóbica • Interacciones iónicas: - Repulsión entre las cargas negativas de los fosfatos • - Los cationes actúan como contraiones estabilizando el dsDNA (cationes divalentes más eficientes que monovalentes; el Mg+2 estabilizala estructura del RNA) ver estructuras secundarias en rRNA, por ejemplo...

27. DNA A: 75% agua (esporos), Na+ DNA B:92% agua Watson & Crick DNA Z: poli-pur-pyr, -GCGC… alta [Na+]

28. ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO Comparación de las formas A, B y Z del DNA La forma B es la más estable en condiciones fisiológicas

29. ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO Horquilla(hairpin-loop) Estructuras inusuales Palíndromos(palindromes) Cruciforme Repeticiones en espejo (mirror repeats)

30. ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO Estructuras inusuales: triplex DNAs Apareamiento tipo Hoogsteen: Bajo ciertas condiciones, los nucleótidos pueden formar puentes de hidrógeno adicionales dando lugar a tramos de DNA de triple hélice. H-DNA: "In vitro" es posible obtener tramos de triple hélice intercalando oligonucleótidos cortos constituidos solamente por pirimidinas (timinas y citosinas) en el surco mayor de una doble hélice. No se sabe la función biológica del ADN-H aunque se ha detectado en cromosomas eucarióticos. Apareamiento tipo Hoogsteen H-DNA Estables a pH bajos (citosina protonada, C+)

31. ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO Estructuras inusuales: cuadruplex DNA DNA cuadruplexo: "In vitro" se han obtenido cuartetos de guanina (DNA cuadruplexo) unidas mediante enlaces tipo Hoogsteen, empleando polinucleótidos que solamente contienen Guanina (G). Los extremos de los cromosomas eucariotas (telómeros) tienen una estructura especial con un extremo 3' OH de cadena sencilla (monocatenario) en el que se repite muchas veces en tandem una secuencia rica en guaninas. Se piensa que el DNA cuadruplexo telomérico serviría para proteger los extremos cromosómicos de la degradación enzimática. Ejemplo de secuencia telomérica rica en guaninas (G): 5´P  TTGGGTTGGGGTTGGGG...............TTGGGG  3'OH

32. Las moléculas de ssRNA pueden exhibir conformaciones variadas

33. Estructuras secundarias en RNA tRNA

34. Propiedades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos • H+ y HO- • Espectro UV • Temperatura de desnaturalización • (estabilidad de la doble hélice a medida que se incrementa la temperatura) • Densidad de flotación • (ultracentrifugación en gradientes de densidad)

35. Hidrólisis en medio ácido Ácidos fuertes : escinden tanto los enlaces fosfodiéster como los enlaces N-glicosídicos. Ácidos débiles : escinden los enlaces N-glicosídicos. Los enlaces de las purinas son más lábiles que de las pirimidinas

36. dsDNA en medio alcalino fuerte desprotonación de los >N-H de los heterociclos ¿...?

37. Hidrólisis en medio alcalino RNA

38. Desnaturalización del ADN

39. Desnaturalización térmica TEMPERATURA DE FUSIÓN = Tm(melting temperature)

40. Propiedades ópticas de los nucleótidos

41. Efecto hipercrómico ssDNA (desnaturalizado a 90 oC)) dsDNA (nativo a 28 oC) The purine and pyrimidine bases in DNA absorb UV light maximally at a wavelength of approximately 260 nm. In double-stranded DNA, however, the absorption is decreased due to base-stacking interactions. When DNA is denatured, these interactions are disrupted and an increase in absorbance is seen. This change is called the hyperchromic effect. The extent of the effect can be monitored as a function of temperature

42. Desnaturalización térmica TEMPERATURA DE FUSIÓN = Tm(melting temperature) medida deA260nm

44. ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO DESNATURALIZACION POR CALOR Desnaturalización del DNA Condiciones que favorecen la desnaturalización • Alta temperatura • Baja fuerza iónica (repulsión de fosfatos) • Alto pH (desprotonación de bases) Monitoreo de la desnaturalización • Los enlaces conjugados de las bases generan absorción en el UV a 260nm Nucleótidos libres> ssADN> dsADN • La temperatura a la cual la A260 alcanza la mitad de su valor máximo es denominada Tm (temperatura de melting) • La Tm depende de la concentración salina, pH, composición, longitud • Oligonucleótidos cortos: Tm (oC) = (A+T)x2 + (C+G)x4 • Oligonucleótidos largos: • Tm = 81.5 +16.6Log [Na+] + 0.41 (%CG) – (625/N) • (N=longitud del oligo) Cálculo de Tm

45. ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO Parámetros que intervienen en la desnaturalización del DNA

46. ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO Densidad de flotación de los ácidos nucleicos Existe una relación lineal entre el contenido en G+C y la densidad del DNA determinada por ultracentrifugación a equilibrio en un gradiente de densidad. A mayor contenido en G+C, mayor densidad. Basándose en múltiples estudios de la densidad de los DNAs de diferentes organismos y de su composición en bases nitrogenadas, se ha establecido una fórmula empírica que relaciona la densidad de flotación () con el contenido en G+C expresado en %:  = 1,660 + 0,00098(G+C)

48. Avances científicos • Disociación y reasociación de las hebras complementarias del DNA(hibridación de sondas o cómo encontrar una aguja en un pajar) • Replicación del DNA in vitro(síntesis de genes usando cada una de las hebras de la doble hélice como molde para la copia) • PCR:amplificación de un segmento de DNA en un tubo de ensayo (cómo leer información a partir de una sola célula, cómo detectar un virus en una muestra de sangre, etc.) • Síntesis de DNA a partir de RNA(transcriptasa reversa de retrovirus)

49. Avances científicos • Enzimas de restricción(tijeras mágicas para cortar DNA en forma precisa) • Ligasa (pegamento especial para unir trozos de DNA: permite la construcción de moléculas recombinantes) • Enzimas de restricción + ligasa = DNA recombinante(ingeniería genética)