240 likes | 467 Views
Univerzita Pavla Jozefa Šafárika Katedra biochémie. Optimali zácia aktivity termofilných enzýmov. Mgr. Kamil Tóth. … Danišovce 2006. Yellowstone 1969. Kamil Tóth. Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov. ● biokatalyzátory chemických reakcií. ● metabolické premeny urýchľujú ~ 10 6 x.
E N D
Univerzita Pavla Jozefa ŠafárikaKatedra biochémie Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Mgr. Kamil Tóth …Danišovce 2006 Yellowstone 1969...
Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●biokatalyzátory chemických reakcií ●metabolické premeny urýchľujú ~ 106 x ●najrýchlejší enzým orotidín monofosát dekarboxyláza ~ 1017 molekúl/sek. ●v primárnej sekvencii zložené z 20 AMK ●enzýmy proteíny Enzýmy
Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●ich štruktúra je tvorená: kofaktor apoenzým ●aktívne miesto – oblasť katalýzy ●evolúcia – selekcia katalytických skupín ●vysoká špecificita ”key and lock” ●prevaha nekovalentných interakcií ●dynamické štruktúry
Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●metabolické dráhy ●imunitný systém ●proteosyntetický aparát... ●bunka živých sústav ~ 3000 enzýmov ●niektoré organizmy sa prispôsobili extrémnym podmienkam... Kde sa enzýmy vyskytujú? ... všade tam, kde prebieha život
Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Acidofily pH 1-5 Barofily Halofily 1-700 atmosfér >2M soľ Psychrofily (Mezofily) 25-40°C -10 až 20°C 50-105°C Termofily termofily 50-80°C hypertermofily >80 °C Extrémofily ●odolnosť v extrémnych podmienkach-vnútorná vlastnosť „dynamická povaha termostability“
Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov NADH oxidáza z Thermus thermophilus kooperácia Prof. Sprinzl, Lehrstuhl Biochemie, Universität Bayreuth, Nemecko ●50 kDa homodimér ●FMN alebo FAD ako kofaktor/monomér ●NADH dehydrogenáza ●pI 9,26 ●hypertermofil Topt.=82°C ●neznáma fyziologická funkcia
Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●proteíny, ktoré majú ako kofaktor naviazaný FAD, FMN alebo iný flavínový derivát ●až 65% flavoproteínov viaže FAD ako kofaktor Biologická všestrannosť ●Citrátový cyklus ●oprava poškodených reťazcov DNA ●rezistencia na tetracyklínové antibiotiká ●Cirkadiálny rytmus – regulácia biologických hodín ●indikátory metabolického a nutričného stavu buniek NADH oxidáza je flavoproteín
Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov flavínmononukletid(FMN) adenozínmonofosfát (AMP) D-ribitol adenozín ribolflavín izoalloxazínflavín Štruktúra FAD flavínadenindinukleotid (FAD)
Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●flavínový kruh pôsobí ako reverzibilný redoxný systém ChinónSemichinón Hydrochinón „Motýlí ohyb“ zbalená forma rozbalená forma
Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Ciele práce: A ●aktivácia termofilného enzýmu NADH oxidázy B ●vytvorenie nehomológnej databázy FAD viažúcich proteínov ●charakteristika interakcií kofaktora a proteínovej časti ●sledovanie preferenčných konformácií voľného FAD a viazaného v aktívnych miestach
Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Význam: ●základný výskum ●biotechnologický priemysel
Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov i) zásahom do primárnej sekvencie – bodové mutácie ii) pôsobením externe modulovaných podmienok ? soli Hofmeisterovej série ...ako je to in vivo Na+, Gdm+, NH4+, Li+, K+ ,Cs+ ●priama interakcia s proteínom ●cytozol 300mg proteínov/ml ●nepriama s molekulami H2O ●existencia voľnej H2O? Aktivácia termofilného enzýmu NADH oxidázy
Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Mechanizmus pôsobenia KM,NADH KM,FMN rovnica Michaelis-Mentenovej ●v ~ aktivita enzýmu ●KM konštanta- miera afinity enzýmu pre substrát
Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●pozitívne nabité aktívne miesto ●nešpecifická aktivácia ●nepriamy efekt na oblasť aktívneho miesta ●nízka koncetrácia solíelektrostatické interakcie ●vysoká koncetrácia solíHofmeisterov efekt
Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Stanovenie KM konštanty pre substrát NADH ●charakteristika interakcie enzým-substrát ●konformačná bariéra ●pre 2M soli K+Na+Cs+> NH4+>Li+>> Gdm+
Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●vytienenie nevýhodných elektrostatických interakcií ●kozmotrópne Li+ stabilizuje štruktúru ●chaotrópne katióny znižujú afinitu Stanovenie KM konštanty pre FMN ako kosubstrát ●komplexný problém objasnenia Hofmeisterovho efektu
Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●plocha prístupná pre rozpúšťadlo: ASA v Å2 ●gyračný polomer: Rg v Å B.Analýza flavínových kofaktorov v aktívnych miestach ●početnosť tvorby vodíkových väzieb subštruktúry FAD
Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●537 flavoproteínov (RCSB Protein Databank) ●55 ortológov ●100 kofaktorov ●priemerné rozlíšenie ~ 2.06 Å 98% oxidoreduktázy 46% α/β štruktúra Databáza flavoproteínov
Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Distribúcia vodíkových väzieb v aktívnych centrách enzýmov ● kritérium rozlíšenia: < 2Å ● 24 flavoproteínov ● parameter popisujúci interakcie v aktívnych miestach sila interakcie vodíkovej väzby: izoalloxazín<pyrofosfát~adenozín<ribityl
Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Konformácia kofaktorov v aktívnych miestach enzýmov
Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov o ●korelácia ASA – plochy prístupnej pre rozpúšťadlo a gyračného polomeru Rg (R=0.844) o Charakteristika rozbalenej konformácie FAD ● ASA – plocha prístupná pre rozpúšťadlo ● Rg -gyračný polomer ● schopnosť tvorby vodíkových väzieb
Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Zhrnutie: • úspešná aktivácia NADH oxidázy katiónmi Hofmeisterovej série • 537 flavoproteínov → databáza 55 nehomológnych flavoproteínov → 100 kofaktorov • určená ASA a bimodálna distribúcia konformácie kofaktora pre oblasť aktívnych miest 75% FAD v rozbalenej a 25% v zbalenej konformácii
Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ...čo do budúcna? ●stanovenie nitroreduktázovej aktivity NADH oxidázy z Thermus thermophilus ●sledovanie aktivity NADH oxidázy v nepolárnych prostrediach ●viazanie flavínového derivátu do apoformy enzýmu
Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov RNDr. Gabrielovi Žoldákovi, PhD. RNDr. Erikovi Sedlákovi, PhD. Prof. Dr. Mathiasovi Sprinzlovi Poďakovanie Vám za vašu pozornosť!