1 / 24

Optimali zácia aktivity termofilných enzýmov

Univerzita Pavla Jozefa Šafárika Katedra biochémie. Optimali zácia aktivity termofilných enzýmov. Mgr. Kamil Tóth. … Danišovce 2006. Yellowstone 1969. Kamil Tóth. Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov. ● biokatalyzátory chemických reakcií. ● metabolické premeny urýchľujú ~ 10 6 x.

zeheb
Download Presentation

Optimali zácia aktivity termofilných enzýmov

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Univerzita Pavla Jozefa ŠafárikaKatedra biochémie Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Mgr. Kamil Tóth …Danišovce 2006 Yellowstone 1969...

  2. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●biokatalyzátory chemických reakcií ●metabolické premeny urýchľujú ~ 106 x ●najrýchlejší enzým orotidín monofosát dekarboxyláza ~ 1017 molekúl/sek. ●v primárnej sekvencii zložené z 20 AMK ●enzýmy proteíny Enzýmy

  3. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●ich štruktúra je tvorená: kofaktor apoenzým ●aktívne miesto – oblasť katalýzy ●evolúcia – selekcia katalytických skupín ●vysoká špecificita ”key and lock” ●prevaha nekovalentných interakcií ●dynamické štruktúry

  4. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●metabolické dráhy ●imunitný systém ●proteosyntetický aparát... ●bunka živých sústav ~ 3000 enzýmov ●niektoré organizmy sa prispôsobili extrémnym podmienkam... Kde sa enzýmy vyskytujú? ... všade tam, kde prebieha život

  5. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Acidofily pH 1-5 Barofily Halofily 1-700 atmosfér >2M soľ Psychrofily (Mezofily) 25-40°C -10 až 20°C 50-105°C Termofily termofily 50-80°C hypertermofily >80 °C Extrémofily ●odolnosť v extrémnych podmienkach-vnútorná vlastnosť „dynamická povaha termostability“

  6. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov NADH oxidáza z Thermus thermophilus kooperácia Prof. Sprinzl, Lehrstuhl Biochemie, Universität Bayreuth, Nemecko ●50 kDa homodimér ●FMN alebo FAD ako kofaktor/monomér ●NADH dehydrogenáza ●pI 9,26 ●hypertermofil Topt.=82°C ●neznáma fyziologická funkcia

  7. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●proteíny, ktoré majú ako kofaktor naviazaný FAD, FMN alebo iný flavínový derivát ●až  65% flavoproteínov viaže FAD ako kofaktor Biologická všestrannosť ●Citrátový cyklus ●oprava poškodených reťazcov DNA ●rezistencia na tetracyklínové antibiotiká ●Cirkadiálny rytmus – regulácia biologických hodín ●indikátory metabolického a nutričného stavu buniek NADH oxidáza je flavoproteín

  8. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov flavínmononukletid(FMN) adenozínmonofosfát (AMP) D-ribitol adenozín ribolflavín izoalloxazínflavín Štruktúra FAD flavínadenindinukleotid (FAD)

  9. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●flavínový kruh pôsobí ako reverzibilný redoxný systém ChinónSemichinón Hydrochinón „Motýlí ohyb“ zbalená forma rozbalená forma

  10. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Ciele práce: A ●aktivácia termofilného enzýmu NADH oxidázy B ●vytvorenie nehomológnej databázy FAD viažúcich proteínov ●charakteristika interakcií kofaktora a proteínovej časti ●sledovanie preferenčných konformácií voľného FAD a viazaného v aktívnych miestach

  11. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Význam: ●základný výskum ●biotechnologický priemysel

  12. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov i) zásahom do primárnej sekvencie – bodové mutácie ii) pôsobením externe modulovaných podmienok ? soli Hofmeisterovej série ...ako je to in vivo Na+, Gdm+, NH4+, Li+, K+ ,Cs+ ●priama interakcia s proteínom ●cytozol 300mg proteínov/ml ●nepriama s molekulami H2O ●existencia voľnej H2O? Aktivácia termofilného enzýmu NADH oxidázy

  13. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Mechanizmus pôsobenia KM,NADH KM,FMN rovnica Michaelis-Mentenovej ●v ~ aktivita enzýmu ●KM konštanta- miera afinity enzýmu pre substrát

  14. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●pozitívne nabité aktívne miesto ●nešpecifická aktivácia ●nepriamy efekt na oblasť aktívneho miesta ●nízka koncetrácia solíelektrostatické interakcie ●vysoká koncetrácia solíHofmeisterov efekt

  15. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Stanovenie KM konštanty pre substrát NADH ●charakteristika interakcie enzým-substrát ●konformačná bariéra ●pre 2M soli K+Na+Cs+> NH4+>Li+>> Gdm+

  16. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●vytienenie nevýhodných elektrostatických interakcií ●kozmotrópne Li+ stabilizuje štruktúru ●chaotrópne katióny znižujú afinitu Stanovenie KM konštanty pre FMN ako kosubstrát ●komplexný problém objasnenia Hofmeisterovho efektu

  17. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●plocha prístupná pre rozpúšťadlo: ASA v Å2 ●gyračný polomer: Rg v Å B.Analýza flavínových kofaktorov v aktívnych miestach ●početnosť tvorby vodíkových väzieb subštruktúry FAD

  18. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ●537 flavoproteínov (RCSB Protein Databank) ●55 ortológov ●100 kofaktorov ●priemerné rozlíšenie ~ 2.06 Å 98% oxidoreduktázy 46% α/β štruktúra Databáza flavoproteínov

  19. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Distribúcia vodíkových väzieb v aktívnych centrách enzýmov ● kritérium rozlíšenia: < 2Å ● 24 flavoproteínov ● parameter popisujúci interakcie v aktívnych miestach sila interakcie vodíkovej väzby: izoalloxazín<pyrofosfát~adenozín<ribityl

  20. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Konformácia kofaktorov v aktívnych miestach enzýmov

  21. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov o ●korelácia ASA – plochy prístupnej pre rozpúšťadlo a gyračného polomeru Rg (R=0.844) o Charakteristika rozbalenej konformácie FAD ● ASA – plocha prístupná pre rozpúšťadlo ●  Rg -gyračný polomer ●  schopnosť tvorby vodíkových väzieb

  22. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov Zhrnutie: • úspešná aktivácia NADH oxidázy katiónmi Hofmeisterovej série • 537 flavoproteínov → databáza 55 nehomológnych flavoproteínov → 100 kofaktorov • určená ASA a bimodálna distribúcia konformácie kofaktora pre oblasť aktívnych miest 75% FAD v rozbalenej a 25% v zbalenej konformácii

  23. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov ...čo do budúcna? ●stanovenie nitroreduktázovej aktivity NADH oxidázy z Thermus thermophilus ●sledovanie aktivity NADH oxidázy v nepolárnych prostrediach ●viazanie flavínového derivátu do apoformy enzýmu

  24. Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov RNDr. Gabrielovi Žoldákovi, PhD. RNDr. Erikovi Sedlákovi, PhD. Prof. Dr. Mathiasovi Sprinzlovi Poďakovanie Vám za vašu pozornosť!

More Related