Apresentação: Ângela Brandão, Bárbara Paes Leme, Liana Sfair Coordenação: Paulo R. Margotto

1. Queda aguda na contagem dos monócitos sanguíneos diferencia enterocolite necrosante (ECN) de outras causas de intolerância alimentar ORIGINAL ARTICLE Acute drop in blood monocyte count differentiates NEC from other causes of feeding intolerance J Remon, R Kampanatkosol ,RR Kaul , JK Muraskas , RD Christensen and A Maheshwari Journal of Perinatology 2014;1-6 (publicação online) Apresentação: Ângela Brandão, Bárbara Paes Leme, Liana Sfair Coordenação: Paulo R. Margotto www.paulomargotto.com.br Brasília, 10 de maio de 2014 Hospital Regional da Asa Sul/Hospital Materno Infantil de Brasília(HMIB) SES/DF Universidade Católica de Brasília/Unidade de Neonatologia

2. Ddas. Bárbara Paes, Fernanda, Liana, Deiseane e Ângela

3. A QUEDA DA CONTAGEM DE MONÓCITOS COMO UM NOVO INDICADOR DE ENTEROCOLITE NECROSANTE

4. INTRODUÇÃO • Enterocolite necrosante (ECN) continua a ser umas das principais causas de mortalidade em crianças nascidas antes de 32 semanas ou com peso ao nascer <1.500g1,2. • O diagnóstico atual baseia-se em achados radiológicos (Pneumatosis intestinalis, alças fixas ou ar na veia3 porta e histopatológicos (necrose por coagulação, pneumatose e inflamação5. • Estes achados são de baixa sensibilidade e reconhecidos tarde na ECN3,6,7. • Há uma ausência de biomarcador confiável para o diagnóstico precoce de ECN, bem como para triagem clínica (tratamentos podem não ser eficazes quando instituídos tarde; inclusão de pacientes sem nunca ter tido ECN).

5. INTRODUÇÃO • Histopatologicamente, a ECN é caracterizada por presença de infiltrado leucocitário rico em macrófagos10, em contraste cm outras causas de disfunção intestinal como dismotibilidade, íleo relacionado a sepse e isquemia-reperfusão11-13. • Já foi previamente mostrado que essas populações de macrófagos intestinais são normalmente mantidas em recrutamento contínuo e diferenciação in situ de monócitos circulantes na lâmina própria14,15.

6. INTRODUÇÃO • RN pré-termos → limitada circulação de monócitos e falta de reserva significativa de monócitos maduros na medula óssea ou outro sítio17 → os autores especulam que maciço influxo de monócitos circulantes para o intestino durante a ECN no pré-termo → queda aguda na contagem de monócitos em sangue periférico, podendo diferenciar ECN precoce de outras causas de intolerância alimentar Durante a ECN

7. INTRODUÇÃO Para comprovar esta hipótese... • Fez-se uma comparação entre a contagem absoluta de monócitos em sangue periférico (no início da intolerância alimentar) em todos os pacientes tratados para ECN comprovada no centro por 10 anos e a contagem de controles pareados de outras causas de intolerância alimentar além da ECN.

8. MÉTODOS • Revisão retrospectiva em nascidos de muito baixo peso com diagnóstico de ECN no Hospital Universitário de Illinois durante janeiro de 2001 a junho de 2011. • Formato utilizado: casos-controle com crianças diagnosticadas com ECN (estágios II e III de Bell), sendo que para cada caso, 3-4 controles foram identificados com base em: • Data de admissão (±3 meses); • Idade gestacional (±1 semana); • Peso ao nascer (±200g); • Presença de intolerância alimentar, mas sem clínica sugestiva ou sinais radiológicos ou evidências histopatológicas de ECN.

9. MÉTODOS • Intolerância alimentar foi definida como a presença de 2 ou mais dos seguintes critérios: • Distensão abdominal; • Resíduos pré-alimentares ≥30% do volume alimentar; • Vômitos; • Diarreia; • Fezes sanguinolentas.

10. MÉTODOS • Crianças com anormalidades congênitas maiores e perfurações intestinais espontâneas na primeira semana pós-natal foram excluídas. • Observaram-se, ainda, características demográficas como: • Peso ao nascer, • Idade Gestacional, • Gênero, • Etnia, • Tipo de parto.

11. MÉTODOS • Outros fatores clínicos relevantes: Apgar, sepse comprovada por hemocultura antes do início da intolerância alimentar, acesso central, canal arterial pérvio, terapia com indometacina, hemorragia intraventricular e idade de incidência da ECN ou intolerância alimentar.

12. MÉTODOS • Dados do leucograma completo: • Data do teste • Contagem de células brancas • Valor absoluto de neutrófilos • Valor absoluto de linfócitos • Valor absoluto de monócitos Foram analisados o HC do início da intolerância alimentar + 3 HCs de seguimento

13. MÉTODOS Análise estatística: • Normalidade da distribuição: teste de Shapiro-Wilk. • Características clínicas (dados contínuos):Teste de Man-Whitney. • Frequência dos fatores de risco: Teste exato de Fisher. • Comparação das contagens seriadas sanguíneas foram comparadas usando o teste de Wilcoxon. • Significância estatística:p<0,05. • Curva ROC: identificar o melhor ponto de corte para a contagem de monócitos para diferenciar entre os RN com ECN e intolerância alimentar. • Regressão logística: para determinar a acurácia diagnóstica da contagem de monócitos sanguíneos no diagnóstico da ECN. • Software usado:Sigma Stat 3.1.1 software (Systat, Point Richmond, CA, USA).

14. MÉTODOS • A validação dos achados em uma coorte independente de pacientes: Para testar a acurácia diagnóstica do valor absoluto de monócitos na ECN foram revisados os registros médicos de crianças tratadas com ECN comprovada no Centro Médico Universitário de Loyola, durante jan-2007 a jan-2011 e registros clínicos de HC recuperados, determinando, assim, a porcentagem de pacientes que foram corretamente identificados com ECN.

15. RESULTADOS • 1654 crianças durante o período de Janeiro 2001-Junho 2011 • 72 pacientes com ECN • Foram excludes 3 por perfuração espontânea intestinal • No final: 69 pacientes com diagnóstico de ECN. • Grupo controle foi de 257 pacientes • 261 episódios de intolerância não associada a ECN.

16. RESULTADOS

17. RESULTADOS • No grupo ECN, 25 (36,2%) e 44 (63,8%) foram classificados em estagio II e III, respectivamente

18. RESULTADOS • Avaliação do sangue: • No grupo ECN, 59/69 (85,5%) tiveram contagem de leucócitos na mediana de 3,5 dias (IRQ:1-6 dias) antes do início do sintomas • No grupo controle, 258/261 (98,8%) tiveram contagem de leucócitos na mediana de de 2 dias (IQR:1-4 dias) • Monócitos pré-sintomáticos Muito baixa nos pacientes com Bell stage II e III no primeiro dia de sintomas e no primeiro follow-up (caiu de 1,7 x 109 I-1 (IQR 0.98 a 2.4) para 0,8 x109 I-1(IQR 0.62 a 2.1); P<0.05 nos pacientes com ECN no estágio II de Bell); caiu de 2,1 x 109 I-1(IQR 0.1.5 a 3.2) para 0.8 (IQR 0.6 a 1.9);P<0.05 nos pacientes com ECN estágio III de Bell). Sem mudanças na contagem de leucócitos, linfócitos e neutrófilos) • -Já no grupo controle, não houve mudanças na contagem de monócitos e também na contagem de leucócitos, neutrófilos e linfócitos. Também não houve diferenças nos grupos com hemocultura positiva e doença ileal, assim como na intolerância “idiopática”

19. *PACIENTES TRANSFERIDOS SEM DOCUMENTAÇÃO DE EXAMES

20. BOXSPLOTS CONTROLE Mudança longitudinal na contagem absoluta de monócitos (AMC) ECN ESTAGIO II

21. ECN ESTAGIO III

22. ROC • Os autores investigaram se a contagem de monócitos (AMC) obtida no início da intolerância alimentar poderia descriminar entre ECN e intolerância alimentar de outras causas. • Os autores normalizaram a contagem de monócitos (AMCs) no início dos sintomas contra a última avaliação pressintomática dos monócitos para cada criança e assim, computaram curvas ROC usando contagens normalizadas de monócitos (referência de Christensen RD et al, 2010-referência 16)(Figura 2). • Para possível aumento da acurácia do diagnóstico, foi feita regressão logística para identificar covariáveis significativamente associadas a ECN, como :Peso ao nascer, Etnia e Sepse. • No entanto, a inclusão destas variáveis no modelo Curva ROC não melhorou a acurácia diagnóstica.

23. O valor de corte com máximo valor de efetividade da contagem de monócitos (AMC) como teste para ECN: = 0,8 • (sensibilidade de 70% e e 70% de especificidade).Tabela 3 • Queda de >20% da contagem de monócitos antes do início da intolerância alimentar identificou corretamente a ECN em 76% dos Área sob a curva:0,76

24. Validação dos achados • Testado o valor do ponto de corte em uma coorte de pacientes tratados para ECN confirmada em Loyola University Medical Center • 23 pacientes  17 Bell II e 6 Bell III • Um leucograma esteve disponível antesdos sintomas (em 21 pacientes), no diados sintomas (23pctes) e 5 dias após. • Houve diminuição da contagem dos monócitos de 1,5 x 109 I-1(IQR 1.1 to 2.8) (pré-sintomas) para 0,9 x 109 I-1 (IQR 0.5 to 1.9)(época da ECN)-P<0.03. • Valor de corte < 0,8 PARA A CONTAGEM DE MONÓCITOS foi identificou em 14/23 (66,7%) com ECN, o qual foi consistente com modelo ROC.

25. DISCUSSÃO • A queda da contagem absoluta de monócitos (absolute monocyte counts – AMC) no sangue periférico pode ser usado como biomarcador para Enterocolite Necrosante em recém nascidos de muito baixo peso. • Uma queda da contagem de monócitos, na época do diagnóstico de intolerância alimentar, descrimina corretamente a ECN da intolerância alimentar por outras causas com uma acurácia de 76%. • Este é o primeiro estudo que usa a queda da contagem de monócitos como diagnóstico adjunto da ECN. • Os neonatologistas não avaliar rotineiramente a contagem de monócitos na sua prática rotineira. • A vantagem desse biomarcador em relação a outros mais complexos (como proteína inibidora inter-alfa, proteínas ligantes a ácidos gordurosos intestinais, hexominidase, proapolipoproteina CII e amilóide sérica A29-34) já tentados: 1) A informação já está disponível, então não há custos extras 2) O seu alto valor preditivo negativo(88%) ajuda a excluir enterocolite de intolerância alimentar devido a outras causas. 3) Como já é automaticamente calculado em muitos laboratórios a contagem de monócitos é rapidamente disponível; vários centros usam a mesma referência, e a técnica de cálculo já é bem padronizada.

26. DISCUSSÃO • O raciocínio é sobre a fisiopatologia: • Na enterocolite necrosante há um infiltrado rico em macrófagos10. • Esses macrófagos são derivados dos monócitos da corrente sanguínea15. • Então o rápido influxo de monócitos na lesão da enterocolite esgota os monócitos do sangue em prematuros16. • Notou-se que a queda de monócitos era a única característica da ECN. • Os pré-termos com crescimento restrito tem baixos monócitos mas também possuem uma supressão de toda a linhagem leucocitária e não somente uma monocitopenia isolada35. • Na UTI Neonatal a monocitose é mais vista, pois aparece associada a diversas situações: prematuridade extrema, transfusões de RBC, infusão de albumina , terapia com teofilina, condidíase e sífilis congênita e neutropenia imunomediada.

27. DISCUSSÃO • Foram analisadas 62 000 contagens de células sanguíneas onde se constatou que: • A concentração de monócitos cresce linearmente entre a 22-42 semanas de gestação16. • A concentração de monócitos também aumenta durante as primeiras 2 semanas pós-natal16. • Esses dados foram consistentes com estudos de cinética em fetos humanos, que mostraram o aumento dos precursores de monócitos41,42. • Nesse estudo, as crianças no grupo de enterocolite teve um início da intolerância a alimentação mais tardio • No grupo controle houve uma maior frequência de hemocultura positiva e clínica abdominal sugerindo um íleo séptico o qual ocorre mais cedo no período neonatal que comparado com a enterocolite43,44. • No grupo controle com intolerância alimentar de vido a sepse não houve alterações na contagem de monócitos, (apesar de descrito monocitose associada a infecção) em relação aos recém-nascidos controle com intolerância alimentar por outras causas que não sepse. • O grupo com ECN teve maior incidência de sinais sistêmicos, sangramento gastrintestinal e mortalidade indicando maior acuidade da doença em relação aos controles.

28. DISCUSSÃO • Limitações do estudo: • Estudo retrospectivo, o que aumenta o risco de viés45. • Amostra pequena e limitada  necessita de validação e um estudo multicêntrico randomizado de coorte e ainda em crianças maiores com ECN. • Não houve a avaliação de variações materno-fetais associadas a enterocolite como Doppler de artéria umbilical anormal, corioamnionite, práticas alimentares, anemia, transfusões e infecções46-48. • A relevância de monócitos em perfuração intestinal espontânea também se mantém incerta ( a perfuração e a enterocolite podem ser difícil de distinguir clinicamente , histopatologicamente e até em relação aos marcadores inflamatórios )49.

29. CONCLUSÃO • Foi identificada a queda de monócitos como novo biomarcador para enterocolite necrosante em RN de muito baixo peso • Quando se compara os monócitos antes da intolerância alimentar com após, há uma acurácia de 76% na identificação da ECN. • Uma queda de monócitos > 20% em RN que desenvolveram recente intolerância alimentar indica ECN com uma sensibilidade de 0,70 e especificidade de 0,71. Esses testes oferecem um valor preditivo negativo alto (88%), o que pode ajudar a excluir o diagnóstico de enterocolite dentre outras causas de intolerância a alimentação

30. Portanto QUEDA DA CONTAGEM DE MONÓCITOS COMO UM NOVO INDICADOR DE ENTEROCOLITE NECROSANTE

31. ABSTRACT

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37. Consultem também Dr. Paulo R. Margotto Valores de Monócitos adotados na Unidade de Neonatologia do HRAS/HMIB/SES/DF

38. Valores de Monócitos adotados na Unidade de Neonatologia do HRAS/HMIB/SES/DF Neonatal blood count in health and disease. Manroe B.L, et al. J Pediatr 1985;106:462-466

39. Descobrir marcadores da ECN que aparecem antes dos sinais clínicos evidentes facilitaria precocemente terapias dirigidas o que poderia melhorar os resultados. • Características do ritmo cardíaco anormal(HRC) foram estabelecidos como um biomarcador para sepse neonatal tardia e mortalidade dos pacientes na UTIN (há redução da variabilidade da frequência cardíaca e desacelerações transitórias ocorrendo frequentemente na fase pré-clinica da sepse).

40. A fisiopatologia da ECN e sepse dividem semelhanças, como a resposta inflamatória sistêmica, o comprometimento hemodinâmicoe a hipoperfusão dos órgãos. • níveis de circulação elevados de citocinas pró-inflamatóriascontribuem para a diminuição da variabilidade da frequência cardíaca (os RN com ECN apresentam elevados níveis circulantes de citocinas, especialmente se bacteremia e necrose intestinal). • Mudanças do índice HRC pode refletir ativação da via colinérgica anti- inflamatória, que tem um papel crítico na defesa do hospedeiro. • Os presente autores descobririam que o HRC anormal semelhantes aos observados na sepse também ocorre em prematuros antes da apresentação clínica da ECN (1 dia antes!). Se os médicos são alertados para esta mudança fisiológica, podem avaliar de perto o paciente e considerar mais testes e tratamentos, com melhores resultados através de intervenção precoce. • Mais interessante: O continuado agravamento do HRC em pacientes com ECNacompanha a evolução clínica destes bebês nos quais dramática resposta inflamatória sistêmica e, em alguns casos, significativa necrose do intestino, muitas vezes, leva à deterioração clínica progressiva mesmo após o início da terapia . • A monitorização contínua do HRC oferece aos médicos informações sobre as alterações fisiológicas sutis associadas a resposta inflamatória sistêmica que precedem a deterioração clínica associada com a ECN, levantando a possibilidade de melhorar os resultados dos pacientes através de uma intervenção mais cedo.

41. Obrigada! Dda. Bárbara Paes, Dda. Fernanda, Dr. Paulo R. Margotto, Dda. Liana, Dda Deiseane e Dda. Ângela