LABORATORIO NACIONAL DE DIAGNÒSTICO VETERINARIO (LNVD)

1. LABORATORIO NACIONAL DE DIAGNÒSTICO VETERINARIO (LNVD) Facultad de Bacteriología y Laboratorio Clínico Universidad de Santander UDES

2. BRUCELOSIS Enfermedad zoonótica, intracelular, afecta a diferentes especies de animales domésticos y silvestres. Barreras en comercialización de los animales y sus productos. Altera desarrollo socioeconómico del sector rural más vulnerable. Distribución mundial. Incidencia variable de unas áreas a otras. Algunos países del centro y del norte de Europa han conseguido su erradicación. En Sudamérica y países mediterráneos, (europeos y africanos) la Enf. continúa siendo frecuente.

3. División BXII. Proteobacteria Clase I Alphaproteobacteria Orden I Rhodospirillales Familia II Acetobacteraceae Género I Acetobacter Género IX Gluconobacter Orden II Rickettsiales Familia I Rickettsiaceae Género I Rickettsia Orden VI Rhizobiales Familia I Rhizobiaceae Género I Rhizobium Género II Agrobacterium Familia III Brucellaceae Género I Brucella Brucella spp.

4. POBLACIÒN SUSCEPTIBLE C Consumidores de leche cruda o de subproductos lácteos o cárnicos contaminados con la Brucella. Veterinarios, manejadores de ganado, vacunadores, operarios en matadero. Población infantil rural y urbana marginal Microbiólogos, Bacteriólogos, Auxiliares de laboratorio

5. AGENTE CAUSAL Brucella spp. Gram negativa, Facultativa, Intracelular Capaz de sobrevivir y multiplicarse en las clls del S. RE No móvil, No esporulado, No posee cápsula Variable en su forma (bacilos muy cortos, cocos o cocobacilos, con una longitud de 0.5 a 0.7 u A por 0.5 a 1.5 L Crece lentamente en medios aeróbicos (parcialmente dependiente de tensiones bajas de CO2) Colonias de tipo mucoso T. Op. crecimiento 37 °C, pH entre 6,6 a 7,4. Es catalasa +, Reacciones bioquímicas según cepa sea lisa o rugosa “A pesar de ser considerado un organismo fastidioso por sus requerimientos en el cultivo puede crecer en medios nutritivos mínimos”

6. Brucella ovis Brucella canis Proteínas (porinas) Lipopolisacárido (sLPS) ESPECIES DEL GÉNERO Brucella spp. Brucella melitensis Brucella abortus Especies lisas Brucella maris Brucella suis Brucella neotomae Especies rugosas

7. Brucella melitensis Agente responsable de la mayoría de los casos humanos. Biotipos (1-3) La especie más patógena e invasiva en el humano. Afecta comúnmente a las cabras, pero puede afectar a bovinos y cerdos.

8. Brucella abortus Principal responsable de la brucelosis bovina Ocho biotipos (1-7 y 9) Menor patogenicidad para los humanos. • Afecta principalmente a bovinos, puede afectar a búfalos, alces, jabalíes, zorros, caballos, ciervos, camellos, perros y cerdos.

9. Brucella suis Se subdivide en 4 biotipos (1-4). Afecta principalmente a los cerdos. También puede afectar a loshumanos. • Brucella neotomae Afecta a roedores silvestres “rata del desierto”

10. Brucella ovis Afecta a ovinos. Estos no se infectan fácilmente con B. abortus pero pueden portarla y excretarla 40 meses después de la infección • Brucella canis Afecta a caninos. Su afección en humanos es rara vez reportada.

11. Brucella maris (B. Pinnipediae, B. Cetaceae) no hay reporte de capacidad zoonótica. Ha extendido el rango ecológico

12. TRANSMICIÒN RESERVORIO SALVAJE (liebre, rata, jabalí, venado) RESERVORIO DOMÉSTICO (vaca, búfalo, cabra, cerdo, oveja) Contacto Indirecto Ambiente Contacto Directo LECHE Y DERIVADOS Vía inhalatoria Vía digestiva INGESTIÓN HUMANO

13. PRINCIPAL Y MÁS COMÚN RUTA DE TRANSMISIÓN Se adquiere por contacto con secreciones infectadas producidas durante los abortos o por ingestión de productos cárnicos o lácticos contaminados

14. BRUCELOSIS BOVINA Enfermedad reproductiva caracterizada por aborto, retención de placenta y problemas de fertilidad en el hospedador principal. Transmisión B. abortus en Bovinos VÌA ORAL: al lamer fetos y descargas genitales de abortos partos e ingestión de pastos contaminados. Exposición in utero o cuando terneros nacidos de vacas sanas, son alimentados con calostro o leche de vacas infectadas Excreción bacterias en descarga vaginal hasta 40 días post exposición y pre-aborto. En secreciones, excreción masiva , hasta por 15 días después del aborto. Después de expulsión de membranas fetales el número de microorganismos eliminados disminuye. La descarga cesa 2-3 meses después de la infección. Quedan portadoras que excretan bacterias intermitentemente por muchos años

15. Produce importantes pérdidas económicas: En Colombia se han estimado alrededor de 44.000 millones de pesos/año. En los bovinos, puede cursar asintomática o severa

16. La dosis, raza, edad, sexo, tiempo de gestación, y la resistencia natural a la enfermedad, influencian la evolución de la infección. RESISTENCIA / SUSCEPTIBILIDAD A LA INFECCIÓN Condiciones de supervivencia de Brucella abortus Suelo: frío 48-73 días Agua: 8-37 C 1-57 días Heces: 1-120 días Desperdicios 12C 1-8 meses Concentrado > 100 días Lana: 12 C 110 días

17. DETECCIÒN DE LA INFECCIÒN • Análisis en suero de hembras >18 meses. Machos > 8 meses • Serología para animales en movilización (venta, exportación, ferias, matadero) • Si hay reactores positivos aislar y solo movilizar para matadero. • Tomar medidas conjuntas para su control y prevención entre Propietario y Veterinario.

18. DIAGNÒSTICO ELISA indirecta en suero y leche en bovinos ELISA competitiva Fijación de complemento Rosa de bengala en sueros PCR (tejidos, leches, cultivos) Cultivo y pruebas bioquímicas: Biología molecular: PCR Detección directa ELISAs indirecta y competitiva Fijación de Complemento Rosa de Bengala Detección indirecta

19. BRUCELOSIS HUMANA Síntomas,1 ~ gripe, puede incluir fiebre, sudoración, cefaleas, mialgias artralgias y debilidad física. Los sistemas osteoarticulares son los más afectados, pero en las fases agudas de la enfermedad, el corazón y el sistema nervioso se pueden afectar. También puede causar síntomas crónicos que incluyen fiebres recurrentes, dolores comunes y fatiga Transmisión • Inoculación por cortes o abrasiones de piel en contacto con placenta o secreciones vaginales contaminadas. • A través de conjuntivas. • Inhalación de aerosoles. • Consumo de leche cruda, derivados lácteos no pasteurizados, carne cruda. • Inoculación accidental de la vacuna animal C19. Dosis infectiva 10 a 100 bacterias • Ha sido sugerida la transmisión sexual .

20. BRUCELLAS QUE CAUSAN LA INFECCIÓN EN HUMANOS Brucella melitensis Brucella abortus Brucella suis Brucella canis

21. BRUCELOSIS HUMANA Sin tratamiento, la tasa de letalidad es menor al 2% y por lo común, sucede como consecuencia de la endocarditis. Como la duración de la enfermedad varía desde una pocas semanas a varios meses, se necesitan pruebas de laboratorio para confirmar el diagnóstico clínico.

22. DIAGNÒSTICO EN HUMANOS Cultivo y pruebas bioquímicas: Biología molecular: PCR Detección: Aislamiento Sangre o MO ELISA Competitiva Fijación de Complemento Rosa de Bengala

23. TRATAMIENTO La terapia antibiótica óptima está aún en discusión. Debido a la localización intracelular de la Brucella, se requiere la asociación de varios antimicrobianos durante varias semanas.

24. CONTROL Y PREVENCIÓN DE BRUCELOSIS EN HUMANOS Control y eliminación de la infección de los reservorios animales. (Resolución ICA 000119) Exigencia de pasteurización de leche. Métodos diagnósticos sensibles y específicos disponibles

25. CONTROL Y PREVENCIÓN DE BRUCELOSIS EN HUMANOS Prevención en grupos ocupacionales: capacitación, educación continuada, uso de equipo de protección. Vacunas en humanos tienen eficacia limitada. Las vacunas vivas, se asocian con potencial de reactivación de patogenicidad.

26. TÈCNICAS DE DIAGNOSTICO • Cultivo de especimenes para el aislamiento • Cultivo masivo de bacterias para la preparación de reactivos diagnósticos • Amplificación de DNA por PCR Cultivos PCR DIRECTAS • Rosa de Bengala • Fijación de Complemento • Elisa Indirecta • Elisa Competitiva. INDIRECTAS

27. Homogenización e incubación (Antígeno + suero) Positiva: FORMACION DE UNA RED DE AGLUTINACIÓN  ROSA DE BENGALA Antígeno: células completas e inactivadas de Brucella abortus Tinción con el colorante Rosa de Bengala a pH 3 para favorecer la actividad de la IgG1 Anticuerpos anti Brucella abortus presentes en suero Negativa: No Formación de la red de aglutinación.

28. FIJACIÓN DE COMPLEMENTO Antígeno Brucella abortus inactivada Anticuerpos presentes en suero Complemento : factor sérico presente en el suero. Función: lisis del complejo antígeno-anticuerpo. (Fuente: suero de cobayo) Glóbulos Rojos Ovinos (GRO) Hemolisina : anticuerpos anti- GRO

29. TBC BOVINA Enfermedad infecto-contagiosa crónica causada por bacterias del genero Mycobacterium. Es una de las enfermedades más importantes del ganado bovino, tanto por su impacto en salud pública como por sus consecuencias económicas para un país. Su incidencia limita el desarrollo de la ganadería y sus productos asociados, incluyendo las exportaciones.

30. TBC BOVINA IMPACTO SOCIAL De acuerdo con lo informado recientemente por la Organización Mundial de la Salud, el número de casos de tuberculosis, en el hombre, supera los 8 millones al año y va en aumento. Los programas de control y eliminación de animales infectados, junto con la pasteurización de la leche, han reducido drásticamente la incidencia de la enfermedad causada por M. bovis, tanto en el hombre como en los animales. Sin embargo, este patógeno está presente en animales de países en desarrollo donde no existen medidas de control adecuadas.

31. TBC BOVINA AGENTE CAUSAL Mycobacterium bovis Afecta, además del bovino, a varias especies animales como caprinos, ovinos cerdos, perros, gatos, monos y al hombre por lo tanto es una enfermedad zoonotica. Otras micobacterias, como el M. tuberculosis (humano) y el M. avium (aviar), también pueden infectar al bovino. Las micobacterias son sensibles a los desinfectantes a base de fenoles, y son resistentes al medio ambiente y a los desinfectantes solubles en el agua.

32. TBC BOVINA SINTOMATOLOGIA • Generalmente tiene un curso crónico • Síntomas variados afectados. La pérdida progresiva de peso y la reducción en la producción de leche o carne son constantes. • Con alguna frecuencia se observa una tumefacción no dolorosa de los ganglios explorables clínicamente • Cuando hay infección hepática o intestinal se presenta diarrea, al igual que infertilidad por endometritis • Algunas veces la tuberculosis pulmonar cursa con signos respiratorios inespecíficos como tos crónica, casi nunca fuerte, sin mucha fuerza. • Las lesiones predominan en pulmón y ganglios linfáticos, en forma de nódulos o granulomas o tubérculos de material purulento-caseoso

33. TBC BOVINA La eliminación del M. bovis por parte de los animales afectados es intermitente. Puede suceder en las etapas tempranas de la enfermedad, cuando aún no son detectables por la prueba de diagnóstico. Vía más frecuente (80 a 90%) de infección: vía aerógena. Aerosoles, toses y secreciones de animales enfermos que expelen gran cantidad de microgotitas que contienen la bacteria. Vía digestiva (10 a 20% de los casos): por el consumo de pastos y alimentos contaminados con secreciones nasales, materia fecal y orina que contienen el agente causal.

34. TBC BOVINA Otras vías no usuales pero probables son: la vía cutánea, congénita y genital. Vía congénita (madre-feto) puede ocurrir hasta en 5% de las vacas afectadas Vía genital, los toros se infectan sirviendo vacas con metritis tuberculosa La transmisión más importante se produce por medio de la inseminación artificial, al utilizar semen de toros infectados

35. TBC BOVINA ¿POR QUÉ CONTROLAR LA ENFERMEDAD? Hay tres razones claves para controlar y/o erradicar la TBC: • Porque se transmiten al hombre, principalmente a los que trabajan en contacto con animales infectados (veterinarios, trabajadores rurales y personal de frigoríficos). • Porque limitan el comercio internacional de productos cárnicos y lácteos, influyendo negativamente en la rentabilidad de las explotaciones. • Porque estas enfermedades generan importantes pérdidas económicas en la producción de carne y leche.

36. TBC BOVINA DIAGNÒSTICO METODOS DIRECTOS En las plantas de sacrificio la inspección de canales es una actividad básica en la vigilancia epidemiológica de la tuberculosis bovina, ya que es allí donde se detectan en los bovinos las lesiones macroscópicas que se ven a simple vista. La presencia de tumoraciones en los diferentes órganos El foco de necrosis presenta una coloración amarillenta con apariencia caseificada y es posible detectar la presencia de calcio; durante la necropsia se perciben como pequeñas granulaciones blanquecinas que crepitan al cortar con el cuchillo. También puede observarse exudado de apariencia purulenta en meninges. Ganglios medianísticos medios aumentados de tamaño y múltiples tubérculos pequeños de tipo caseoso

37. TBC BOVINA DIAGNÒSTICO • Coloración de Ziehl Nielsen:identifica la presencia de bacilos acido alcohol resistentes, no formadores de esporas inmóviles y no encapsulados, características del género Mycobacterium. • Histopatalogía,proporciona resultados presuntivos. En cualquiera de las formas en que se presenta la tuberculosis, esta se caracteriza por la formación de granulomas. Se pueden detectar bacilos ácido alcohol resistentes libres en el citoplasma de los macrófagos, histiocitos y células gigantes de la lesión granulomatosa. METODOS DIRECTOS

38. TBC BOVINA DIAGNÒSTICO METODOS DIRECTOS El cultivo bacteriológico proporciona el diagnóstico definitivo de la enfermedad. Las micobacterias son aerobios obligados que crecen en medios sintéticos simples, pero para el aislamiento primario a partir de muestras clínicas se requiere de un medio más complejo como el medio Löwestein-Jensen, o como el medio Middlebrook. El cultivo dura de 3 a 6 semanas en desarrollarse, las colonias son pequeñas, secas y con aspecto escamoso. El material requerido para aislar el M. bovis debe ser ganglios, pulmones, hígado, bazo, riñón, pleura o cualquier otro tejido donde se aprecien las lesiones características.

39. TBC BOVINA DIAGNÒSTICO METODOS NDIRECTOS Evalúan la Rta mediada por células. El PPD bovino es un derivado proteico purificado producido a partir de cultivos inactivados de Mycobacterium bovis. Prueba Tuberculinica Cervical Simple: consiste en la inoculación intradérmica de 0,1 ml de PPD bovina, previa limpieza con un producto no-irritante, en el tercio medio del cuello, previo corte de pelo a maquina o tijera en el lugar de inyección, en una superficie de 5 a 6 cm. La lectura se hace a las 72 horas (más o menos 6 horas). Las reacciones se consideran negativas cuando no se observa ni palpa ningún cambio en la piel del sitio de aplicación y reactoras cuando es visible y/o palpable un engrosamiento de 4-5 mm.

40. TBC BOVINA DIAGNÒSTICO METODOS NDIRECTOS Prueba Tuberculinica Ano-Caudal: Eesta prueba se realiza en el pliegue ano-caudal interno a unos 6 cm. de la base de la cola y en el en el tercio medio del pliegue ano-caudal interno. Esta zona es menos sensible a la tuberculina que la piel del cuello. Se inyectan 0.1 ml de PPD bovina, previa limpieza con un producto no-irritante. La lectura se hace a las 72 horas (más o menos 6 horas). Las reacciones se consideran negativas cuando no se observa ni palpa ningún cambio en la piel del sitio de aplicación y reactoras cuando es visible y/o palpable un engrosamiento de 4-5 mm.

41. TBC BOVINA DIAGNÒSTICO METODOS NDIRECTOS Prueba tuberculínica comparativa: La prueba intradérmica comparativa se utiliza para la realización de un diagnostico diferencial entre animales infectados por Mycobacterium bovis y aquellos sensibilizados a la tuberculina por exposición a otras micobacterias. Esta prueba consiste en la inyección de tuberculina bovina y tuberculina aviar, previa limpieza con un producto no irritante, en diferentes puntos del cuello y en la subsiguiente evaluación de la respuesta transcurridas 72 horas. Para esta prueba comparativa la dosis de tuberculina no debe ser inferior a 2.000 UI de tuberculina bovina ni a 2.00 UI de tuberculina aviar. La distancia entre ambas inyecciones debe ser de aproximadamente 12 a 15 cm. Un animal se considera positivo cuando en la zona de inyección de la tuberculina bovina hay una reacción de 4mm mayor que la tuberculina aviar y se considera dudoso cuando esa reacción es entre 1 y 4mm mayor que la tuberculina aviar. El animal es negativo cuando no hay reacción o cuando la reacción es igual o menor que la tuberculina aviar.

42. TBC BOVINA Otras pruebas que estudian la respuesta de tipo celular detectando la presencia de citocinas circulantes incluyen: DIAGNÒSTICO METODOS NDIRECTOS La prueba de gamma-Interferón Se realiza con sangre completa y tiene mayor sensibilidad y especificidad que la intradermo reacción. Se emplean los mismos antígenos (PPD) y detecta el mismo grupo de animales infectados. Las ventajas con respecto a la intradermo reacción es que el animal se maneja sólo una vez. Los inconvenientes son su costo y la necesidad de procesar la sangre inmediatamente después de su extracción. Prueba de ELISA Indirecta Detección de anticuerpos séricos. Posee baja sensibilidad, pero es muy fiable en la detección de vacas "anérgicas" a las pruebas de la tuberculina y gamma-Interferón.

43. TBC BOVINA DIAGNÒSTICO METODOS NDIRECTOS Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Amplificación de secuencias génicas, Su eficacia radica en la rápida identificación de patógenos de difícil cultivo. En ese contexto, el desarrollo de un procedimiento que identifica directamente M. bovis en muestras de tejido y secreción proveniente de animales tuberculosos debe ser el objetivo de todos los países.