1 / 27

Vom Molekül zur Zelle Block 3 Seminar / Praktikum 2

Vom Molekül zur Zelle Block 3 Seminar / Praktikum 2. Diese Präsentation befindet sich auf der Lehr-Inhalts Seite des Departments unter www.meduniwien.ac.at/Medbch/Teaching. Georg Weitzer, Ernst Müllner Max F. Perutz Laboratories (MFPL)

zola
Download Presentation

Vom Molekül zur Zelle Block 3 Seminar / Praktikum 2

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Vom Molekül zur ZelleBlock 3Seminar / Praktikum 2 Diese Präsentation befindet sich auf derLehr-Inhalts Seite des Departments unterwww.meduniwien.ac.at/Medbch/Teaching Georg Weitzer, Ernst MüllnerMax F. Perutz Laboratories (MFPL) Department für Medizinische BiochemieMedizinische Universität Wien, Jan 2007

  2. Der praktische Teil der 2. Übung findet statt am:Institut fürMedizinische Chemie Währingerstraße 10Übungssaal I, 1. Stock

  3. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Enymatische MethodenEnzymatische Reaktionen • Enzym = E • Substrat = S • Produkt = P • Coenzym (Cosubstrat) = CoE E +S ES EP E + P E+S+CoEES-CoEEP-CoE´E + P + CoE´ Coenzym wird verändert (CoE, CoE’), wird aber in einer anderen Reaktion recyclet, daher auch der Name “Cosubstrat

  4. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Was Sie wissen sollten: Aktivität von Enzymen (Biokatalysatoren) wird beeinflusst durch • pH- Wert (Optimim, aber auch Denaturierung) • Temperatur (Optimum, aber auch Denaturierung) • Hemmstoffe (in der Medizin: Medikamente!) • kompetitive (erhöhen den Km Wert) • nicht-kompetitive Anmerkung: bei der kompetitiven Hemmung konkurrieren ein Agonist (Substrat) und ein Antagonist (Hemmstoff) um die Bindungsstelle an einem Enzym. Bei der nicht-kompetitiven Hemmung bindet der Antagonist nicht an der Substrat-Bindungsstelle.

  5. [E] x [S] Km = [ES] Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Für die Reaktionsgeschwindigkeit v einer enzymatischen Reaktion gilt: vmaxx [S] v = [S] + Km Michaelis-MentenGleichung Km entspricht der Substrat-Konzentration, bei der das Enzym mit der Hälfte der maximalen Geschwindigkeit arbeitet. Die Reaktionsgeschwindigkeit v einer enzymatischen Reaktion in Abhängigkeit von der Substratkonzentration [S] nach der Michaelis-Menten Gleichung kann auch grafisch dargestellt werden.

  6. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Graphische Darstellung der Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion Bestimmung derSubstratkonzentration Bestimmung derEnzymmenge v v... Umsatzgeschwindigkeit vmax ... Maximale Reak- tionsgeschwindigkeit Km = [S] bei vmax / 2(Km = Michaelis-Menten Konstante) ([S] = Substratkonzentration) ... daher Km in mol/l [S] Abbildung aus: Ergänzung der theoretischen Grundlagen und biochemisches Praktikum im Block 3 - Vom Molekül zur Zelle, Facultas Verlag, Hans Goldenberg (Hg.) es gilt bei Vmax/2: [E] = [ES]

  7. Wikipedia Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Lineweaver-Burk Diagramm Geradengleichungk = Steigung y = k x x + d  y = d + k x x 1 / v = 1 / vmax + (Km / vmax) x 1 / [S] Durch Umformung der Michaelis-Menten Gleichung in eine doppelt-reziproke Form kann die Reaktionsgeschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion in einem Linweaver-Burk Diagramm dargestellt werden. Dies hat vor allem für die Auswerung der Daten Vorteile. k = (1 / vmax) / (1 / Km)

  8. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Beispiel 1 Kinetische Untersuchung der Lactatdehydrogenase:Bestimmung der Km Bestimmung derSubstratkonzentration v modiziert nach „Ergänzung“, H. Goldenberg [S]

  9. COO- C O CH3 COO- HO C H CH3 Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Was macht die Lactatdehydrogenase? Coenzym C2H5OH-COOH + NAD+CH3CO-COOH + NADH + H+ gemessene Reaktionsrichtung Lactat Pyruvat • Diagnose von Herzinfarkt durch die Aktivitätsbestimmung von herzspezifischen Enzymen im Blut • Kreatinkinase (CK-MB) • Laktatdehydrogenase

  10. -H Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Was macht NAD+?Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid ist ein Elektronen transportierendes Coenzym, das an zahlreichen Redox-Reaktionen des Stoffwechsels beteiligt ist. Dabei kann es reduziert werden und maximalzwei Elektronen (dann geschrieben als NADH) aufnehmen. Hier gezeigt am Beispiel der Umwandlung (Oxidation) von Ethanol zu Acetaldehyd.

  11. 340 Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Absorptionsspektrum von NAD+ und NADH Im Gegensatz zu NAD+ zeigt NADH ein starkes Absorptionsmaximum bei 340 nm (langwelliges UV-Licht). Im Zuge der Reaktion von Pyruvat zu Lactat nimmt (durch gleich-zeitige Umwandlung von NADH in NAD+) die Absorption von UV-Licht ab.

  12. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Messung der Lactatdehydrogenaseaktivität ... ... und Darstellung der Ergebnisse in einemLineweaver-Burk Diagramm LDH spielt eine (Neben)rolle bei der Glykolyse im Citratzyklus. Durch die Umwandlung von Lactat in Pyruvat wird NADH produziert, das seinerseits als energielieferndes Co-enzym der Atmungskette zur ATP Bildung beiträgt. Im Praktikum wird hingegen die Umwandlung von Pyruvat in Lactat gemessen, wobei NAD+ gebildet wird. -1 / Kapp

  13. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Messen der Umsatzgeschwindigkeít bei verschiedenen Substratkonzentrationen [S] = Pyruvat nochmals: gemessen wird die Reaktion in der Richtung vom Pyruvat zum Lactat, wobei NADH in NAD+ umgewandelt wird. zunächst Herstellung einer Verdünnungsreihe „Ergänzung“, H. Goldenberg

  14. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Probenvorbereitung alle Volumina in µl „Ergänzung“, H. Goldenberg Durch Zugabe von 20 µl Lactatdehydrogenase wird die Reaktion gestartet

  15. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Arbeitsplatz

  16. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Photometer

  17. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Lambert-Beersches Gesetz E =exc x d E = log (1/T) = log (I0/I) E = Extinktion e = spez. Molarer Extinktionskeoff.c = Konzentration d = Schichtdicke T = Transmission I0 I Lichtquelle Prisma Küvette d = 1 cm Photometer Detektor

  18. Zusatz von LDH Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Messung der Lactatdehydrogenaseaktivität niedrige Pyruvatkonzentration hohe Pyruvatkonzentration modiziert nach „Ergänzung“, H. Goldenberg k = v für gegebene [S]

  19. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Messung der Extinktionsänderung bei jeder Substratkonzentration E = ex c x d c = E / (ex d) Dc / Dt = DE / (ex d xDt) = v Abnahme der Extinktion in Abhängigkeit von der Dauer der Reaktion messen (wie in der Grafik zuvor dargestellt).

  20. Zusatz von LDH Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Auswertung der Messdaten durch Umwandlung in ein Lineweaver-Burk Diagramm ... Jedes “k” (Steigung links) entspricht einem Punkt im Diagramm rechts

  21. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 ... durch Eingabe in ein Computer-Datenblatt (Excel, I)

  22. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 ... durch Eingabe in ein Computer-Datenblatt (Excel, II) nicht alles muss immer stimmen ...

  23. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Berechnung der vmax Dc(s) / Dt = DE / (ex d xDt) = v

  24. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Geschafft!

  25. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Beispiel 2Bestimmung der Lactatdehydrogenaseaktivität im Serumbei verschiedenen Enzymmengen Bestimmung derEnzymmenge v modiziert nach „Ergänzung“, H. Goldenberg [S]

  26. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Experimentelle Vorbereitungen „Ergänzung“, H. Goldenberg 1. Lösungen 2 bis 4 mischen 2. LDH Lösung zugeben 3. Abnahme der NADH Konzentration messen

  27. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Gemessen wird wieder die Abnahme der Extinktion pro Zeiteinheit, aber diesmal in Abhängigkeit von der Enzymmenge k = DE / min Zusatz von LDH wenig Enzym viel Enzym modiziert nach „Ergänzung“, H. Goldenberg Aktivität (U/l) = DE / min x Konstante

More Related