80 likes | 341 Views
Elektroforéza nukleových kyselin. Princip metody. pohyb elektricky nabitých molekul v poli stejnosměrného elektrického proudu rozdělení složek směsi dle jejich náboje velikosti prostorové struktury Použití
E N D
Princip metody • pohyb elektricky nabitých molekul v poli stejnosměrného elektrického proudu • rozdělení složek směsi dle jejich • náboje • velikosti • prostorové struktury Použití • separace NK–DNA, RNA, produkty PCR, restrikce…. -agarosové gely-horizontální uspořádání • separace proteinů, krátkých úseků NK (<100bp) - polyakryalamidové gely-vertikální uspořádání
Elektroforéza na agarosovém gelu • gely slouží jako „síto“ • kratší molekuly DNA se gelem pohybují rychleji než dlouhé úseky NK Agarosa: • polysacharid z mořských řas • bílý prášek jehož vodný roztok po zahřátí a ochlazení tvoří pevný gel • dle koncentrace gelu lze separovat kratší či delší úseky DNA
Směr pohybu NK !!! Postup 1) Příprava gelu: odměřené množství agarosy se rozpustí v pufru, přivede k varu,nalije do vaničky s hřebenem a nechá ztuhnout 2) Příprava vzorku: vzorek NK smísit se vzorkovým pufrem (vyšší hustota, barvičky) 3) Ze ztuhlého gelu vyjmout hřeben, gel umístit do elfo. vany s pufrem 4) Podvrstvením pod hladinu pufru se do jednotlivých jamek nanášejí vzorky 5) Připojení stejnosměrného elektrického pole 6) Detekce rozdělených NK- ethidium bromid + UV
Elektroforetickáaparatura • zdroj elektrického proudu • elektroforetická vanička s pufrem • připojení ke kladnému a zápornému pólu • pufr • agarosový gel
fosfodiesterová vazba fosfodiesterová vazba 2’-deoxyribosa Struktura DNA
DetekceNK • interkalace ethidium bromidu do DNA • fluorescence EtBr po osvícení UV světlem