CITOGENETICA E APPLICAZIONI DIAGNOSTICHE

1. CITOGENETICA E APPLICAZIONI DIAGNOSTICHE • La citogenetica classica e molecolare è associata alla diagnostica Morfologica, Fenotipica. • Le malattie ematologiche nelle quali si realizza routinariamente sono sempre più numerose. Serravalle Salvatore

2. L’ESAME EMOCROMOCITOMETRICO Nel midollo esistono due grandi categorie (o serie ) di cellule: la linfoide (che comprende un tipo di globuli bianchi, i linfociti, e le plasmacellule che da essi originano) e la mieloide ( detta anche non linfoide) che comprende in pratica tutti gli altri tipi di cellule (globuli rossi, globuli bianchi, piastrine e loro precursori). Le cellule più immature di entrambe le serie vengono chiamate blasti ed in condizioni normali sono meno del 5% di tutte le cellule midollari.

3. Rappresentazione schematica della cascata differenziativa. Tutte le cellule del sangue si originano nel midollo osseo da una popolazione di cellule staminali pluripotenti che, differenziandosi, seguono una definita cascata differenziativa: la neoplasia può insorgere in una delle diverse fasi della via di maturazione linfoide o mieloide.

4. DEFINIZIONE • A.Se la trasformazione tumorale riguarda i blasti • della serie linfoide si parla di leucemialinfoblasticaacuta (ALL); • B.Negli altri casi si parla di leucemia mieloideacuta • (AML); • altri sinonimi per questa malattia sono leucemia mieloblastica acuta(AML) • onon linfoblastica acuta(ANLL) Nelle leucemie acute i blasti midollari sono in genere superiori al 30%.

5. CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE NEOPLASTICHEDEL TESSUTO EMOPOIETICO E LINFOIDEWorld Health Organization - 1997 NEOPLASIE MIELOIDI Malattie mieloproliferative Leucemia Mieloide Cronica, cromosoma Philadelphia positiva [t(9;22)(q34;q11), bcr/abl] Leucemia cronica neutrofilica Leucemia cronica eosinofilica / sindrome ipereosinofila MieloFibrosi Idiopatica cronica Policitemia Vera Trombocitemia Essenziale Malattia mieloproliferativa non classificata Malattie mielodisplastiche / mieloproliferative Leucemia MieloMonocitica Cronica Leucemia mieloide cronica atipica Leucemia mielomonocitica giovanile Sindromi mielodisplastiche Anemia Refrattaria con sideroblasti ad anello senza sideroblasti ad anello Citopenia refrattaria (sindrome mielodisplastica) con displasia multilineare Anemia Refrattaria (sindrome mielodisplastica) con Eccesso di Blasti Sindrome 5q- Sindrome MieloDisplastica non classificata Leucemie Acute Mieloidi LAM con traslocazioni citogenetiche ricorrenti: LAM con t(8;21)(q22;q22), aml1(cbfa )/eto LA Promielocitica [LAM con t(15;17)(q22;q21) e var, pml/rara] LAM con eos. mid. [inv(16)(p13;q22) o t(16;16), cbfb/myh11] LAM con anomalie 11q23 (mll) LAM con displasia multilineare con precedente sindrome mielodisplastica senza precedente sindrome mielodisplastica LAM e sindromi mielodisplastiche correlate a terapie correlate ad agenti alchilanti correlate a epipodofillotossine altri tipi LAM non altrimenti classificate LAM scarsamente differenziata, M0 LAM senza maturazione, M1 LAM con maturazione, M2 LA promielocitica, M3 LA mielomonocitica, M4 LA monocitica, M5 LA eritroide, M6 LA megacariocitica, M7 LA basofilica Panmielosi acuta con mielofibrosi Leucemie acute bifenotipiche

6. CLASSIFICAZIONE DELLE MALATTIE NEOPLASTICHEDEL TESSUTO EMOPOIETICO E LINFOIDEWorld Health Organization - 1997 NEOPLASIE LINFOIDI Neoplasie delle cellule B Neoplasie dei precursori B Leucemia / linfoma B linfoblastica (Leucemia Acuta Linfoblastica B) Neoplasie delle cellule B mature (periferiche) Leucemia Linfocitica Cronica B / linfoma a piccoli linfociti B Leucemia prolinfocitica B Linfoma linfoplasmocitico Linfoma splenico B delle zona marginale (+/- linfociti villosi) Leucemia a cellule capellute Mieloma a plasmacellule / plasmocitoma Linfoma extranodale B delle zona marginale di tipo MALT Linfoma nodale B delle zona marginale (+/- cellule B monocitoidi) Linfoma Follicolare Linfoma a cellule Mantellari Linfoma Diffuso a Grandi Cellule B linfoma a grandi cellule B del mediastino linfoma primary effusion Linfoma di Burkitt / leucemia a cellule di Burkitt Neoplasie delle cellule T e NK Neoplasie dei precursori T Leucemia / linfoma T linfoblastica (Leucemia Acuta Linfoblastica T) Neoplasie delle cellule T mature (periferiche) Leucemia prolinfocitica T Leucemia linfocitica T granulare Leucemia a cellule NK aggressive Linfoma / leucemia T dell’adulto (HTLV1+) Linfoma extranodale NK/T, tipo nasale Linfoma T, tipo enteropatia Linfoma T epatosplenico gamma-delta Linfoma T sottocutaneo tipo panniculite Micosi Fungoide / Sindrome di Sezary Linfoma anaplastico a grandi cellule, T / null, tipo primitivo cutaneo Linfoma a grandi cellule T periferiche, non altrimenti classificato Linfoma T angioimmunoblastico Linfoma anaplastico a grandi cellule, T / null, tipo primitivo sistemico Linfoma di Hodgkin (LH) DISORDINI LINFOPROLIFERATIVI POST-TRAPIANTO (PTLD) NEOPLASIE DELLE MAST CELLULE NEOPLASIE DELLE CELLULE ISTIOCITICHE E DENDRITICHE

7. Leucemie acute linfoblastiche (ALL) 70% Leucemie acute non linfoblastiche (AML) 30-40% Leucemie mieloidi croniche (LMC) 3% Leucemie linfocitiche croniche (CLL) rare Relazioni evidenti tra INSORGENZA MALATTIA e PRESENZA di ALTERAZIONI CROMOSOMICHE  sono coinvolti Geni per fattori di trascrizione  Anomalie regolazione del sistema emopoietico e dei processi apoptotici

8. Geni coinvolti nei tumori GENI MUTATORI:responsabili del mantenimento dell’integrita’ del genoma durante le replicazione cellulare. ONCOGENI: geni la cui azione promuove positivamente la proliferazione cellulare. ONCOSOPPRESSORI (TS): i prodotti di tali geni inibiscono la proliferazione cellulare.

9. Geni di Fusione • Si definiscono geni di fusione gli oncogeni associati a traslocazioni cromosomiche specifiche, generati dalla ricombinazione tra due geni. • Danno origine a m-RNA chimerici il cui prodotto e’ espresso ed e’ neoplastico se entrambi i due oncogeni sono funzionanti. • Un tipico esempio e’ l’oncogene PML-RAR alfa associato alla t(15;17) ed alla Leucemia Acuta a promielociti.

10. Cellule normali e cancerose CELLULE NORMALI CELLULE CANCEROSE • INIBIZIONE DA CONTATTO • PERDITA INIBIZIONE DA CONTATTO • INCAPACI DI CRESCERE IN SOSPENSIONE • (ECCEZIONE I LINFOCITI) • CRESCONO IN SOSPENSIONE • DIPENDENTI DAI FATTORI DI CRESCITA • INDIPENDENTI DA FATTORI DI CRESCITA • MORTALI • IMMORTALI

12. 5 avvolgimenti 2nm della doppia elica sezione della 11nm cromatina fibra di 30nm con i nucleosomi 30nm strettamente impacchettati parte di una sezione 300nm di cromosoma sezione condensata 700nm di un cromosoma metafasico 1400nm cromosoma metafasico CITOGENETICA : Processo di analisi che valuta il numero e la forma dei cromosomi. Le cellule umane contengono 46 cromosomi. I geni, cioè frammenti specifici di DNA, sono i principali costituenti dei cromosomi. In un singolo cromosoma sono mediamente presenti 2.000 geni. I cromosomi X e Y, sono quelli che determinano il sesso: Nella donna sono presenti due cromosomi X,e nell’uomo un X e un Y.

13. CITOGENETICA

14. Lunghezza del cromosoma Costituenti del cromosoma TELOMERO COSTRIZIONE SECONDARIA CENTROMERO (COSTRIZIONE PRIMARIA) p TELOMERO q CARIOTIPO Il cariotipo si esegue sull’immagine dei 46 cromosomi ottenuta mediante fotografia o immagine computerizzata. Costituita da 22 coppie appaiate, nelle quali uno dei cromosomi è di origine paterna ed una di origine materna. Sono distinti a seconda della lunghezza (dal più lungo al più corto) ed in base alle caratteristiche morfologiche (visibile con la tecnica del “bandeggio”). I cromosomi del sesso (XX o XY) vengono evidenziati come coppia separata.

15. Lab.Oncoematologia pediatrica (BO) CARIOGRAMMA BASATO SULLA LUNGHEZZA CROMOSOMICA E SULLA POSIZIONE DEL CENTROMERO METAFSE METAFASE CON NUCLEO IN INTERFASE

16. GRUPPO CROMOSOMI CARATTERISTICHE A 1, 2, 3 Cromosomi grandi con centromeri in posizione mediana. B 4, 5 Cromosomi grandi con centromeri sub-mediani. C 6, 7, 8, 9, 10,11,12 Cromosomi di media grandezza con centromeri sub-mediani D 13, 14, 15 Cromosomi di media grandezza con centromeri terminali. E 16, 17, 18 Cromosomi piccoli con centromeri mediani e sub-mediani. F 19, 20 Cromosomi piccoli con centromeri mediani. G 21, 22 Cromosomi molto piccoli e acrocentrici.

17. BANDEGGIAMENTOCROMOSOMICO Lo sviluppo del bandeggiamento (Caspersson, 1968 ) ha costituito un progresso decisivo per le analisi citogenetiche e ha permesso di individuare singoli cromosomi. Vari trattamenti denaturanti consentono di colorare cromosomi, modo riproducibili secondo una sequenza di bande chiare e scure. Il numero del cromosoma è seguito da p (braccio corto) o q (braccio lungo) e dal numero della banda, esempio 11q23 significa, l’estremità del braccio lungo q del cromosoma 11, banda 2 sottobanda 3. .

18. Cariotipo Convenzionale (CC) Aspirato midollare (sangue periferico) Colorazione (bandeggio) Conteggio nucleate Selezione e cattura immagini Semina in terreno Elaborazione e cariotipizzazione Coltura per 24 - 72 h Colchicina Fissazione e lavaggi Allestimento dei vetrini Conclusione diagnostica

19. Lab.Oncoematologia pediatrica (BO) • Bandeggio GTG (G-Trypsin-Giemsa): • E’ uno dei bandeggi più largamente utilizzati. Consiste nel trattare i cromosomi con un enzima proteolitico, la tripsina, che digerisce le proteine istoniche. • - In seguito si immergono i vetrini in una soluzione di Giemsa, una miscela di azur II ed azur II eosina, e questo consente la visualizzazione delle bande cosiddette G. METAFASE DA ORDINARE

20. Lab.Oncoematologia pediatrica (BO) CARIOTIPO COSTITUZIONALE: METAFASE ORDINATA La standardizzazione internazionale della nomenclatura dei cromosomi umani del 1981 aggiornata nel 1995 (ISCN 1995) identifica ciascuna banda e sottobanda cromosomica in 400, 550 ed 850 bande.

21. Bandeggio QFQ (Q-Fluorescence-Quinacrine): • Il bandeggio Q-Fluorescence-Quinacrine è costituito da una colorazione fluorescente. • E’analogo a quello G. • Il contrasto inoltre è inferiore a quello ottenibile con il bandeggio G (Gravholt and Friedrich 1995). Alterazioni: 2p- 5q- 11q+ Lo svantaggio di questa tecnica deriva dal fatto che la fluorescenza decade rapidamente per cui il bandeggio è temporaneo.

22. Bandeggio CBG (C-Barium-Giemsa): -Questa tecnica prevede un processo di denaturazione e rinaturazione grazie all'impiego di idrossido di bario, seguita dalla colorazione con Giemsa. - Permette di mettere in evidenza tutte le regioni centromeriche.

23. Quali sono le anomalie cromosomiche Di numero trisomie monosomie triploidie tetraploidie Di struttura traslocazioni inversioni delezioni duplicazioni

24. anomalie cromosomiche di numero ESEMPIO di TRISOMIA Cromosoma 21

25. Trisomia 13 Sindrome Patau anomalie cromosomiche di numero ESEMPIO di TRISOMIA Trisomia 18 Sindrome Edward

26. MONOSOMIA 22 Lab.Oncoematologia Pediatrica (BO)

27. Esempio di TRIPLOIDIA 69, XXX; XXY; XYY

28. Lab.Oncoematologia Pediatrica (BO) TETRAPLOIDIA

29. anomalie cromosomiche di struttura

30. Traslocazioni cromosomiche I geni coinvolti sono per lo piu’ fattori di trascrizione, ma anche tirosin o serin protein chinasi, recettori di membrana cellulare, fattori di crescita, con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo cellulare

31. Traslocazioni cromosomiche • Deregolazione dell’espressione genica: • overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene. • Espressione di una proteina di fusione: • giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomi

32. LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2) Nelle leucemie acute mieloblastiche, la traslocazione t(8;21) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida.

33. Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA t(15;17)(q22;q21) La traslocazione t(15;17) coinvolge il gene che codifica per il recettore nucleare a dell'acido retinoico (RAR) sul cromosoma 17, ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15. VARIANTI • t(11;17)(q23;q22) PLZF-RARα; • t(5;17)(q35;q21) NPM-RARα; • t(11;17)(q13;q21) NuMA-RARα; • t(17;17)(q11;q21) STAT5b-RARα;

34. LEUCEMIA ACUTA MIELOMONOCITICA Con eosinofili LAMM4 Inversione (16) gene di fusione CBFB-MYH11

35. Lab.Oncoematologia Pediatrica (BO) CARIOTIPO COMPLESSO : Atassia Telangectasia

36. ALTERAZIONI CROMOSOMICHE Anemia Fanconi

37. Lab.Oncoematologia Pediatrica (BO) INTERRUZIONE CROMATINA CROMOSOMA 2 BRACCIO p

38. CROMOSOMA DICENTRICO Lab.Oncoematologia Pediatrica (BO) MONOSOMIA 22 La citogenetica classica permette di avere una visione globale del cariotipo e fornisce gli spunti per ulteriori studi mirati e più approfonditi tramite FISH.

40. Cariotipo Convenzionale Ibridazione in Situ (CC) (FISH) Aspirato midollare (sangue periferico) Scelta delle sonde Colorazione (bandeggio) Conteggio nucleate Denaturazione e Ibridazione over night Selezione e cattura immagini Semina in terreno Lavaggi e controcolorazione Elaborazione e cariotipizzazione Coltura per 24 - 72 h Valutazione immagini Colchicina Cattura / elaborazione Fissazione e lavaggi Allestimento dei vetrini Conclusione diagnostica Conclusione diagnostica

41. La Citogenetica Molecolare FISH Permette un’analisi mirata di una regione cromosomica consentendo di mettere in evidenza riarrangiamenti di alcune centinaia di chilobasi. Tale identificazione avviene mediante sonde marcate impiegando fluorocromi che emettono a diverse lunghezze d’onda.

42. SONDE: -  Sonde locus-specifiche:sono sonde molto piccole che riconoscono porzioni corte del cromosoma; vengono utilizzate per evidenziare aberrazioni che coinvolgono un gene o una parte di esso. -  Sonde chromosome painting:riconoscono sequenze specifiche per ogni singolo cromosoma localizzate lungo tutto il suo asse; il cromosoma appare interamente colorato. -  Sonde centromeriche (o alfoidi):riconoscono brevi sequenze centromeriche di DNA altamente ripetitive, specifiche per ciascun cromosoma. Tali sonde, che generano un segnale intenso. - Sonde telomeriche:sono utili nell'identificazione di traslocazioni che coinvolgono le regioni telomeriche.

43. Metafase e Interfase normale Metafase Traslocata Lab.Oncoematologia Pediatrica (BO) SONDA (LSI) DOPPIO COLORE PER t(PML /RAR ) DESCRIZIONE METAFASE e INTERFASE NORMALI, MOSTRANO: 4 SEGNALI DUE VERDI (RARA regione 17q21,1) DUE ROSSI (PML regine 15q22). METAFASE TRASLOCATA, MOSTRA: UN SEGNALE VERDE (RARA) UNO ROSSO (PML) e UN SENALE DI FUSIONE DEI DUE GENI GIALLO/BIANCO (PML-RARA)

44. Locus CBF e relativa sonda Risultato atteso patologico . . . . . . . . normale Risultato effettivo Lab.Oncoematologia Pediatrica (BO) L.A.M. M.4(Leucemia Acuta Mielomonocitica con eosinofili)

45. LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE(FAB M5) • ANOMALIE DELLA BANDA CROMOSOMICA 11q23 CON RIARRANGIAMENTI DEL GENEMLL IL GENE MLL (Myeloid/Lymphoid Leukemia), noto anche come ALL1 (Acute Lymphoblastic Leukemia) oppure HRX (per l’omologia con il gene Trithorax della Drosofila) • I RIARRANGIAMENTI DI QUESTO GENE SONO STATI • TROVATI INDISCRIMINATAMENTE IN: • LEUCEMIE LINFOBLASTICHE ACUTE (LAL), • LEUCEMIE MIELOIDI ACUTE (LAM) • LEUCEMIE SCARSAMENTE DIFFERENZIATE O BIFENOTIPICHE

46. Posizione del gene MLL  FISH LSI DOPPIO-COLORE •  La presenza di una traslocazione e’ evidenziabile • dalla formazione di due segnali separati: • segnale su cromosoma 11 con MLL :VERDE • segnale su cromosoma traslocato: ROSSO • segnale su cromosoma 11 normale: GIALLO

47.  Riarrangiamento di MLLt (?:11) (?;q23) in infant LAM M5 Risultato atteso patologico Traslocato . . . . . . . . normale Risultato effettivo Normale Risultato effettivo Risultato effettivo Lab.Oncoematologia Pediatrica (BO) Interphase FISH

48. ArgBP2 4q35.1 NUOVO PARTNER DI TRASLOCAZIONE DI MLL 11q23 Partners

49. METAFASE NORMALE METAFASE E INTERFASE TRASLOCATA Lab.Oncoematologia Pediatrica (BO) CARATTERISTICHE FISH PERTEL/AML1 ( LLA) IN NUCLEI E METAFASI NORMALI SI HANNO I 2 SEGNALI ROSSI E 2 VERDI DISTINTI. NEI TRASLOCATI SI OSSERVA UN SEGNALE ROSSO (AML1 NORMALE) GRANDE, UNO VERDE (TEL NORMALE) GRANDE, UNO GIALLO (TEL/AML1 TRASLOCATO) E UNO PICCOLO ROSSO (RESIDUO DI AML1).

50. Metafase normale Metafase con TRISOMIA Lab.Oncoematologia Pediatrica (BO) SONDE CHE COLORANO TUTTO IL CROMOSOMA. painting