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Citogenetica 2

Citogenetica 2. La citogenetica e` lo studio dei fenomeni genetici attraverso l ’ analisi citologica dei cromosomi al microscopio. Ferguson-Smith. Lezione 2. Analisi del cariotipo. 1) Allestimento della coltura. 2) Preparazione dei vetrini.

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Citogenetica 2

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Presentation Transcript

  1. Citogenetica 2 La citogenetica e` lo studio dei fenomeni genetici attraverso l’analisi citologica dei cromosomi al microscopio. Ferguson-Smith Lezione 2

  2. Analisi del cariotipo 1) Allestimento della coltura 2) Preparazione dei vetrini 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine 4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini

  3. Allestimento del preparato fitoemoagglutinina (stimola la crescita) colchicina (ultimi 30’) Ipotonica (20’) sangue periferico centrifugazione proliferazione centrifugazione 48-96h terreno di coltura pellet risospeso allestimento del preparato risospensione in poco fissativo fissativo fissativo pellet risospeso centrifugazioni (2-3)

  4. Analisi del cariotipo 1) Allestimento della coltura 2) Preparazione dei vetrini 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine 4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini

  5. Metodi colorazione differenziale • Colorano una regione specifica di alcuni o di tutti i cromosomi C-bande : tutti i centromeri e le regioni eterocromatiche variabili dei cromosomi 1,9,16,Y • Creano un’alternanza di bande chiare e scure lungo l’asse del cromosoma • specifica per ogni coppia di omologhi.

  6. Cariotipi a confronto 1-3 gruppo A 4-5 gruppo B X-6-12 gruppo C 13-15 gruppo D 16-18 gruppo E 19-20 gruppo F Y-21-22 gruppo G

  7. QM-banding pattern utilizzando la mostarda di quinacrina......

  8. DAPI e QM

  9. C-bande

  10. G-bande

  11. HSA1 HSA14 G QM G QM

  12. R-bande

  13. Analisi del cariotipo 1) Allestimento della coltura 2) Preparazione dei vetrini 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine 4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini

  14. Ottima ma….. by GP&NA

  15. Puo’ essere anche cosi’... • Cromosomi non ben riconoscibili, difficili anche da contare. Scartare!(potendo) by GP&NA

  16. .. O cosi’ • Troppo contratti pero’ si puo’ usare per contarli. Scartare! (potendo) by GP&NA

  17. Selezione delle metafasi • Sufficiente • Si possono contare Puo’ essere utile per analizzare i cromosomi non sovrapposti by GP&NA

  18. Selezione delle metafasi • Discreta • Si possono contare, e anche se ci sono alcune sovrapposizioni, si possono analizzare by GP&NA

  19. Selezione delle metafasi • Buona • Si possono contare, e anche se ci sono alcune sovrapposizioni, la morfologia dei cromosomi e’ buona by GP&NA

  20. Come si fa il cariotipo? 1. SI CONTANO I CROMOSOMI : IMPORTANTE PER SOSPETTARE LA PRESENZA DI ALTERAZIONI NEL NUMERO CROMOSOMICO 2. SI APPAIANO GLI OMOLOGHI PER SIMILARITA’ 3. SI METTONO IN ORDINE SECONDO LA CONVENZIONE by GP&NA

  21. Fare il cariotipo 46 10 9 11 16 by GP&NA

  22. Cariotipo ordinato CARIOTIPO IN QM (indicare il bandeggio) by GP&NA

  23. Diagramma

  24. Terminologia 46,XX - cariotipo normale Femminile 46,XY - cariotipo normale Maschile • Questo modo di scrivere ci da’ due informazioni: • numero totale dei cromosomi (46) • sesso dell’organismo 47,XY,+21 Maschio con 47 cromosomi (invece di 46) ed un cromosoma 21 in piu’ (sindrome di Down) 46,XX,del(14)(q23) del=delezione 46,XY,dup(14)(q22q25) dup= duplicazione 46,XX,r(7)(p22q36) r=ring (cromosoma ad anello)

  25. FISH sintesi di una sonda complementare marcata con un fluorocromo cromosoma sul vetrino denaturazione A T C G G T A T C C T A G G C A T A G G A T A T doppia elica di DNA A T C G G T A T C C T A G G C A T A G G A T A T ibridazione della sonda sui cromosomi denaturati sul vetrino A T C G G T A T C C T A G G C A T A G G A T A T A C C T T A T denaturazione G C G T A A T C G G T A T C C T A A T C G G T A T C C T A G G C A T A G G A T G G C A T A G G A T G G C A T A G G A T A A A T T T osservazione del vetrino

  26. Principio della fluorescenza

  27. Osservazione al microscopio FISH : microscopio a fluorescenza • fotografia CCD camera filtro di emissione Lampada a vapori di mercurio specchio dicroico filtro di eccitazione Elaborazione al computer obiettivo/ condensatore by GP&NA

  28. FISH: metafase in DAPI Cromosomi 1. denaturati 2. colorati con DAPI by GP&NA

  29. FISH: segnali Sonde puntiformi fluorescenti

  30. FISH: merge Sovrapposizione dell’immagine della sonda sull’immagine del DAPI

  31. SONDE PER FISH

  32. DAPI MERGE SONDA WCP

  33. DAPI MERGE SONDA PCP

  34. SONDE PUNTIFORMI BAC chr1 BAC chrX

  35. COIBRIDAZIONE DI 3 SONDE PUNTIFORMI COIBRIDAZIONE DI 2 SONDE PUNTIFORMI

  36. COIBRIDAZIONE DI 2 SONDE PUNTIFORMI CON WPC

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