DESARROLLO DEL SISTEMA CRISPRCas9 -GRUPO 1

1. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL DESARROLLO DEL SISTEMA CRISPR/Cas9 EN Chlorella vulgaris FSP-E PARA POTENCIAR LA ACUMULACION DE LIPIDOS ASIGNATURA: BIOTECNOLOGÍA DOCENTE: Dr. Hebert Hernan Soto Gonzales • AUTORES: • Briana Lizeth Enriquez Chambi • Juan José Manzano Laura • Luis Gustavo Manzano Laura • Yadira Maydelli Fiño Laquihuanaco

2. Introducción ciertas especies pueden modificar su composición química en respuesta a cambios ambientales optimizar el aumento de lípidos mediante la modificación del gen de la desaturasa de ácidos grasos omega-3 (fad3). CRISPR/Cas9 • Alta tasa de crecimiento • Adaptabilidad a condiciones externas • Capacidad de producir biomasa sin competir por tierras agricolas ventajas sobre las plantas superiores EN ESTE ESTUDIO • Fuente sostenible de bioproductos: • etanol • butanol • compuestos de alto valor Chlorella vulgaris Nannochloropsis spp. Chlamydomonas reinhardtii Microalgas CRISPR/Cas9 Producción de bioenergía = costosa proteínas de la nucleasa FokI Chlorella sorokiniana CRISPR/Cas9 • nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) • nucleasas activadoras de transcripción (TALENs) Vectores con proteína fluorescente verde (GFP) Caracterización de la transformación

3. 2.Materiales y métodos Cepas de Chlorella vulgaris y Chlorella sorokiniana TAP DH5 Alpha Cell (2) • Reactivos químicos: • Solución de fenol-cloroformo • Tinte de Nile red para análisis de lípidos. • Dimetilsulfóxido • Antibiótico higromicina B • pHSE401 • pCAMBIA1302 • (6) • Equipos de laboratorio: • Espectrofotómetro • Microscopio de fluorescencia invertido • Electrotransformador • Centrífuga • Termociclador gen fad3 Omega 3

4. Resultados y Discusiones 3.1. Expresión de mGFP en Chlorella sorokiniana mediante el vector pCAMBIA1302 logro expresar una proteína de fluorescencia verde (mGFP) en la microalga Chlorella sorokiniana usando un vector de expresión llamado pCAMBIA1302.

5. introducir el vector en las células de Chlorella sorokiniana seleccionaron 11 colonias transgénicas introducir el vector en las células de Chlorella sorokiniana MEDIO (llamado TAP), tanto con 20 µg/mL de higromicina como sin el antibiótico Medición de la fluorescencia de mGFP: Las cepas transgénicas emitieron una fluorescencia mGFP más intensa (1500 unidades arbitrarias ) en comparación con las cepas WT (1000 au).

6. 3.2. mGFP expression in Chlorella vulgaris FSP-E by pCAMBIA1302 vector 3.3. Edición génica de fad3 mediante CRISPR/Cas9 en Chlorella vulgaris FSP-E El vector pHSE401 fue adaptado para, edición genética en plantas con CRISPR/Cas9. Las pruebas confirmaron que las cepas transgénicas presentaban modificaciones, verificando la edición exitosa De las 50 cepas transgénicas de CV, (las cepas 10, 29 y 48) para compararlas con Tw, Las células de CV crecieron más rápido que Chlorella sorokiniana, el vector pCAMBIA1302 también es efectivo en Chlorella vulgaris,

7. ANÀLISIS CRONOLÒGICO El crecimiento celular, la tendencia del pH, la concentracion de lipidos y el contenido de lipidos entre las cepas y trangenicas se mostraron en la Fig. 6 TASA DE CRECIMIENTO PH La cepa 6 creció mas rápido que las demás desde el día 2 hasta el día 4 por lo que la biomasa mas alta llego a 1.21 g7L. .Normalmente la biomasa se mantuvo en el nivel de 1.02 a 1.20 g/L en 5 dias de cultivo

8. ANÀLISIS CRONOLÒGICO CONTENIDO DE LIPIDOS DE TIPO SALVAJE(WT) Y TRANSFORMACION 4,5 Y 6 DE C vufgoris FSP-E DESPUES DE LA EDICION CRISPR Cas 9 en el gen/odS CONCENTRACION DE LIPIDOS

9. La cepa 6 mostro una importante region de delecion genetica, mientras en las cepas 4 y 5 se produjo un cambio de marco. El contenido de lipidos se veia afectado por estres quimico como salinidad en Chiamydimonas sp. y el efecto sinergico entre la luz y el nitrato mostro un mayor contenido total de acidos grasos en C. vuigoris El uso de la nueva herramienta genetica CRISPR/Cas9 se ha demostrado por primera vez en C. vidgoris y ha mejorado la biomasa y el contenido de lipidos simultaneamente. Esta exitosa y pontente herramienta se implantara en otras especies de Cholrella en el futuro.

10. Conclusión Siendo la era del oro verde, las microalgas han atraído recientemente un considerable interés en todo el mundo, debido a su gran potencial comercial. Poseen muchas aplicaciones y pueden utilizarse para producir muchos tipos diferentes de metabolitos, como lípidos, proteínas, pigmentos y compuestos bioactivos a través de la biorrefinería de microalgas. Se requieren nuevas herramientas de edición genética para desarrollar y manipular la vía metabólica para equilibrar el crecimiento celular y la acumulación de aceite.

11. ¡GRACIAS POR SU ATENCIÓN!