RESISTÊNCIA DE PLANTAS DANINHAS A HERBICIDAS:

1. RESISTÊNCIA DE PLANTAS DANINHAS A HERBICIDAS: DEFINIÇÕES E SITUAÇÃO ATUAL DA RESISTÊNCIA NO BRASIL E MUNDO Pedro Jacob Christoffoleti Área de Biologia e Manejo de Plantas Daninhas Departamento de Produção Vegetal - ESALQ/USP

2. 2.2 Origem da resistência e fatores que interagem 2.2.1 Fatores genéticos 2.2.2 Fatores bioecológicos 2.2.3 Fatores agronômicos 2.3 Bases para a resistência de plantas daninhas a herbicidas 2.3.1 Perda de afinidade do herbicida pelo local de ação 2.3.2 Metabolismo e detoxificação do herbicida 2.3.3 Redução da concentração do herbicida no local de ação 1. INTRODUÇÃO RESISTÊNCIA DE PLANTAS DANINHAS A HERBICIDAS 2. DEFINIÇÕES E SITUAÇÃO DA RESISTÊNCIA NO BRASIL E MUNDO 2.1 Definição de resistência 2.3. Glyphosate – resistência ou tolerância? 2.4 Casos de resistência registrados no Brasil (situação mundial e brasileira) 3. CONSIDERAÇÕES FINAIS

3. Exige mudanças no sistema de produção 1. INTRODUÇÃO - Evolução das plantas é conseqüência da pressão de seleção - Plantas daninhas apresentam ampla variabilidade genética que permite sobreviver em diversidade de ambientes - Nos últimos anos, herbicida é o principal método de controle - Nas últimas décadas têm-se observado seleção de populações de plantas daninhas, a partir de biótipos resistentes a alguns herbicidas (Christoffoleti, 1997) • Conseqüências da resistência: • restrição ou inviabilização da utilização dos herbicidas • perdas de rendimento e qualidade dos produtos agrícolas • maiores custos com o controle de plantas daninhas

4. 2. DEFINIÇÕES E SITUAÇÃO DA RESISTÊNCIA NO BRASIL E MUNDO 2.1Definição de resistência

5. “é a capacidade herdável de uma planta sobreviver e reproduzir Definição de resistência “é a capacidade herdável de uma planta sobreviver e reproduzir após à exposição a um herbicida, que normalmente seria letal para a população original” “é a capacidade herdável de uma planta sobreviver e reproduzir após à exposição a um herbicida • Plantas resistentes ocorrem naturalmente em baixa freqüência • A pressão de seleção exercida pelo herbicida aumenta a freqüência das plantas resistentes

6. População suscetível após a aplicação de um herbicida inibidor da ALS 100 % dos Indivíduos suscetíveis Bidens pilosa L.

7. População resistente após a aplicação de um herbicida inibidor da ALS Indivíduo resistente Indivíduo suscetível Bidens pilosa L.

8. População resistente após a aplicação de um herbicida inibidor da ALS 100 % dos Indivíduos resistentes Bidens pilosa L.

9. Doses (kg i.a./ha) correspondentes aos GR50 dos biótipos resistente (R) e suscetível (S) de Euphorbia heterophylla e a relação R/S. Fonte: Gazziero et al. (1998) Doses (g i.a./ha) correspondentes aos GR50 do biótipo de Bidens pilosa resistente (R) e suscetível (S) aos herbicidas inibidores da ALS Fonte: Christoffoleti (2002)

10. Doses (g i.a./ha) correspondentes aos GR50 do biótipo de Bidens pilosa resistente (R) e suscetível (S) aos herbicidas inibidores da ALS Fonte: Christoffoleti (2002) Doses (kg i.a./ha) correspondentes aos GR50 dos biótipos resistente (R) e suscetível (S) de Euphorbia heterophylla e a relação R/S. Fonte: Gazziero et al. (1998)

11. Resistência cruzada x Resistência múltipla Resistência cruzada: • Resistência a diferentes herbicidas que têm o mesmo sítio de ação e/ou mecanismo de ação • Geralmente o mecanismo de resistência é resultante de uma alteração no sítio de ação do herbicida O que é sítio de ação?

12. Sítio de ação dos herbicidas inibidores do transporte de elétrons (inibidores da fotossíntese) Cytocromo QA QB e- e- e- e- Plastoquinona

13. Cytocromo QA QB Planta suscetível e- Plastoquinona H QB Cytocromo QA e- e- e- e- Plastoquinona Planta resistente H

14. Sítio de ação comum dos herbicidas A e B Sítio de ação dos herbicidas A, B e C

15. Resistência cruzada x Resistência múltipla Resistência múltipla: • Resistência a herbicidas não relacionados quimicamente entre si e que apresentam mecanismos de ação diferenciados • Geralmente o mecanismo de resistência é via metabolismo

16. Classificação dos herbicidas de acordo com o mecanismo/sítio de ação Herbicide Resistance Action Committee (HRAC) “The industry get together!” Representantes da Indústria “o conhecimento dos sítios de ação dos herbicidas nas plantas (mecanismos de ação) é fundamental para compreensão da resistência” .

17. Duas teorias de origem da resistência são propostos: • a teoria da mutação (mudança gênica) • genes pré-existentes que conferem resistência à população (seleção natural) 2.2 Origem da resistência e fatores que interagem no desenvolvimento da resistência a herbicidas • As mutações ocorrem ao acaso e são pouco freqüentes • Não existem evidencias que a mutação seja induzida pelos herbicidas

18. 2.2.1 Fatores genéticos que interagem no desenvolvimento da resistência a herbicidas - Freqüência inicial do biótipo resistente - Dominância dos alelos resistentes - Tipo de fecundação - Número de alelos resistentes - Adaptação ecológica

19. A. Freqüência inicial do biótipo resistente Anos para seleção da população resistente, dependendo do grupo de herbicida Vidal & Fleck, 1997 – adaptado de Preston, 2003

20. Inicialmente ocorrem “falhas” na forma de reboleiras

22. Simulação da evolução da resistência em função aplicação repetitiva de um herbicida inibidor da ALS. NPRM2 PRR 15 8 Planta daninha gene R dominante e autógama 6 10 4 Eficácia do herbicida = 98% 5 2 Freqüência inicial de R = 10-8 0 0 0 2 4 6 8 Número de anos Número de plantas resistentes/m2 (NPRM2) (Ovejero & Christoffoleti, 2002) NPRM2 PRR

23. B. Dominância dos alelos resistentes C.tipo de fecundação D.e número de alelos 1Herança maternal não envolve recombinação gênica; 2Casos de herança nuclear onde a metabolização é o mecanismo de resistência. Fonte: Vidal & Fleck, 1997.

24. (Gressel & Segel 1985) (f.=2) f=0,5; =75% ou f=1,0; =50% Anos - 30% de freqüência do biótipo R 2 recessivos ou 4 dominantes 1 recessivo ou 2 dominantes 1 recessivo + 1 dominante ou 3 genes dominantes 1 dominante Freqüência inicial do biótipo resistente

25. Herança da resistência em biótipos de E. Heterophylla Vargas et al., 2001 • A resistência aos herbicidas inibidores da ALS é controlada por um alelo nuclear dominante • Não há diferenças no grau de resistência entre os biótipos homozigotos resistentes e heterozigotos quando submetidos a aplicações de inibidores da ALS, sugerindo-se de tratar de um caso de dominância completa para este gene

26. E. Adaptação ecológica - capacidade do biótipo em manter ou aumentar sua proporção ao longo do tempo em uma população

27. Biomassa (g/pl.) (Christoffoleti, 2000) Dias após semeadura CURVAS DE CRESCIMENTO DOS BIÓTIPOS DE B. pilosa R E S AOS HERBICIDAS INIBIDORES DA ALS Suscetível Resistente

28. CURVAS DE CRESCIMENTO DOS BIÓTIPOS DE E. heterophylla R E S AOS HERBICIDAS INIBIDORES DA ALS (Brighenti et al, 2001) Resistente Suscetível

29. 2.2.2 Fatores bioecológicos que interagem no desenvolvimento da resistência a herbicidas • Espécie • Número de gerações por ano e taxa de reprodução • Longevidade das sementes no banco de sementes • Densidade da espécie • Suscetibilidade da planta daninha ao herbicida

30. 2.2.3 Fatores agronômicos que interagem no desenvolvimento da resistência a herbicidas • Característica do herbicida • Grupo químico • Residual • Eficiência de controle • Dose utilizada • Característica do herbicida

31. Predição do surgimento de plantas daninhas resistentes em função do grau de eficiência do herbicida (Fonte: Powles et al., 1997, citado por Merotto Jr, 1998).

32. 2.2.3 Fatores agronômicos que interagem no desenvolvimento da resistência a herbicidas • Práticas culturais • Utilização exclusiva de herbicidas no controle de plantas daninhas • Uso repetitivo do mesmo herbicida ou de herbicidas com o mesmo mecanismo de ação • Freqüência de aplicação • Sistema de cultivo

33. Baixo Alto Opções de manejo Moderado Mistura ou rotação de herbicidas > 2 mec. de ação 2 mec. de ação 1 mec. de ação Formas de controle de plantas daninhas Cultural, mecânico e químico Cultural e químico Somente químico Uso do mesmo mec. de ação por ciclo Uma vez Mais de uma vez Muitas vezes Sistema de cultivo Rotação plena Rotação limitada Sem rotação Resistência relativa ao mec. de ação Desconhecida Limitada Comum Nível de infestação Baixo Moderado Alto Controle nos últimos 3 anos Bom Decrescente Baixo

34. Porquê alto risco de seleção de populações resistentes aos inibidores da ALS? • uso repetitivo na agricultura • alta eficácia • atividade residual no solo • resistência determinada geneticamente por locus simples-semi-dominante • alelo R tem efeitos mínimos na adaptabilidade do biótipo R na ausência do herbicida • mutações pontuais que podem conferir resistência a um ou mais herbicidas inibidores da ALS

35. Gene ALS 5’ 3’ Extração PCR DNA Total Fragmento Amplificado por PCR Clonagem ...ATCGGTAC... Sequenciamento Plasmídio PUC 18 Sequenciamento do DNA de Bidens que codifica a região de domínio A da ALS

36. Seqüência de aminoácidos na ALS A122 P197 A205 W574 S653 CTP 0 100 200 300 400 500 600 Número do aminoácido Em todos os casos de resistência estudados até o momento a resistência aos inibidores da ALS tem sido atribuída a mudanças na seqüência dos aminoácidos (Sathasivan et al. 1990)

37. Razões do baixo risco de seleção de populações resistentes ao glyphosate 1. Aplicado há mais de 25 anos na agricultura 2. Poucos casos de populações resistentes (4 spp R)

39. 2. Freqüência inicial baixa do biótipo resistente ao glyphosate: • Teoria de saturação mutagênica com Arabidopsis thaliana Heynh. • Não foi possível isolar mutantes a partir de populações induzidas a mutações • Para os inibidores da ALS foram obtidas altas freqüências de mutantes resistentes

40. 3. Tecnologia atual da EPSPS • Substituição da alanina por uma glicina na posição 96 da Escherichia coli conferiu resistência ao glyphosate • Plantas transgênicas exibiram altos níveis de resistência ao glyphosate • Este tipo de mutação gerou efeito paralelo (pleiotrópico) de redução da afinidade da EPSPS ao PEP que torna a planta incapaz de produzir a demanda de aminoácidos aromáticos • Planta menos competitiva e que não se estabeleceria dentre as plantas daninhas

41. 3. Tecnologia atual da EPSPS • O gene que codifica a EPSPS resistente ao glyphosate utilizado na cultura de soja é de strains de Agrobacterium spp. (CP4) • O grau de homologia da seqüência de aminoácidos entre a EPSPS da CP4 e das plantas é de 23 a 41% • Portanto, seria impossível um gene de planta daninha para EPSPS sofrer mutação tão drástica que fosse altamente resistente e que apresentasse afinidade ao PEP

42. 4. Características bioquímica, química e biológica • Apresenta estrutura química singular • Os herbicidas aplicados em mistura ou em rotação com o glyphosate apresentam mecanismos de ação alternativos • Esta rotação ou mistura de herbicidas é comprovadamente uma estratégia recomendada para prevenção e manejo de populações resistentes

43. Corda-de-viola Trapoeraba Seleção de plantas daninhas tolerantes ao glyphosate

45. Absorção de 14C-glyphosate por Commelina benghalensis, Ipomoea grandifolia, Amaranthus hybridus e Glycine max resistante (R) e susceptible (S) ao glyphosate. C. benghalensis I. grandifolia Soja S Soja R % glyphosate 14C absorvido A.hybridus Horas após tratamento Monquero et al. (2002)

46. Cromatografia de camada fina das ceras epicuticulares com os valores de Rf (hidrocarbonos (rf=0.9), éster (rf=0.8), alcoóis secundários (rf=0,4), álcool primário (rf=0,1). O glyphosate é predominantemente hidrofílico (ácido fraco) + lipofílica - lipofílica C. benghalensis I. grandifolia • A. hybridus Monquero et al. (2002)

47. Microscopia eletrônica da superfície foliar C. benghalensis I. grandifolia A. hybridus Monquero et al. (2002)

48. Efeito da aplicação seqüencial de glyphosate transorb 30 DAA Intervalo entre as aplicações = 15 dias 15 DAA grama-boiadeira 100 90 80 70 60 % de controle 50 40 30 20 10 0 Doses 1 2 3 4 5 6 7 8 9 2+2 2+1 3 2,5+2 2+2,5 2,5+1 4 5 Test. 2,5+2,5 20,0 21,7 13,3 26,7 26,7 35,0 33,3 60,0 53,3 0,0 15 DAA 71,7 80,0 88,3 68,3 90,0 98,3 63,3 81,7 78,3 0,0 30 DAA Tratamentos Monsanto, 2002

49. A. hybridus (sementes/m2) nas diferentes avaliações

50. C. benghalensis (sementes/m2) nas diferentes avaliações