1 / 25

聚合酶链式反应 (PCR) ( P olymerase C hain R eaction)

聚合酶链式反应 (PCR) ( P olymerase C hain R eaction). 实验目的. 掌握 PCR 技术的原理及技术. 实验原理. PCR （ Polymerase Chain Reaction ）法，又称为聚合酶链反应或 PCR 扩增技术，是一种高效快速的体外 DNA 聚合程序。 利用 PCR 技术可在短时间内获得数百万个特异的 DNA 序列的拷贝。 PCR 技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到了广泛的应用。 使用 PCR 法的前提条件是：已知待扩增目的基因或 DNA 片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。.

abeni
Download Presentation

聚合酶链式反应 (PCR) ( P olymerase C hain R eaction)

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 聚合酶链式反应(PCR) (Polymerase Chain Reaction)

  2. 实验目的 掌握PCR技术的原理及技术

  3. 实验原理 PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序。利用PCR技术可在短时间内获得数百万个特异的DNA序列的拷贝。PCR技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到了广泛的应用。使用PCR法的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。

  4. PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分为三步：1变性：在高温条件下，DNA双链解离形成单链DNA；2退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3延伸：在DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达到106~7个拷贝。

  5. PCR技术原理

  6. PCR技术的参数 主要有7个：聚合酶、引物、dNTPs、反应buffer、二价离子、模板、一价离子

  7. 模 板 单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。虽然PCR可以仅用极微量的样品（甚至是来自单一细胞的DNA），但是为了保证反应的特异性，一般用ng量级的克隆DNA，μg水平的染色体DNA或104拷贝的待扩增片段来做起始材料。原料可以是粗制品，但不能混有任何蛋白酶，核酸酶，TaqDNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白，因此DNA样品纯度要尽可能的高。

  8. 引 物 PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。下列原则有助于引物的合理设计： * 引物长度以15～30个碱基为宜。 * (G＋C)含量最好保持在约40%～60%，应尽量避免数 个嘌呤或嘧啶的连续排列。 *避免引物内部形成二级结构。 * 两个引物之间不应发生互补。 * 引物浓度不宜偏高。

  9. dNTP浓度 高浓度dNTP易产生错误掺入，而浓度过低，势必降低反应产物的产量。PCR常用50－200μmol/L的dNTP，此外，dNTP能与Mg2＋结合，使游离Mg2＋浓度降低。因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2＋浓度。

  10. 反应buffer 反应缓冲液一般含10-50mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+。 50mmol/L的KCl有利于引物的退火。另外,反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性, 各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。

  11. Mg2＋浓度 * Mg2＋浓度对反应物的特异性及产量有显著影响。浓度过高，则DNA不易变性；浓度过低，使产物减少。 * 在各种单核苷酸浓度为200μmol/L时，Mg2+为1.5mmol/L较适合。若样品中含EDTA或其他螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。

  12. PCR用酶的特性

  13. 温泉中水生嗜热杆菌

  14. TaqDNA聚合酶 Taq多聚酶从嗜热菌分离得到，现在经基因克隆的重组体产物Taq酶最适pH8.3-8.8(室温8.3-8.4),反应温度75-80℃, 95℃以上失活明显。无3´→5´校读活性，对SDS敏感。 在100μl反应液中，一般加入2.5U的酶量，足以达到每分钟延伸1000～4000个核苷酸的掺入速度。酶量过多导致产生非特异性产物。

  15. PCR反应参数

  16. 变性温度与时间 • 94-95度/1min 可以满足一般要求 • 变性时间过长易造成酶失活

  17. 退火温度 一般设定比理论Tm低5℃，但实际上与引物一级结构序列有关，设计不当可造成非特异性扩增，此时应调整温度和相应的时间，一般提高温度会增加扩增的特异性。短时间退火有利于产物的特异性。

  18. 延伸温度和时间 延伸温度一般72度。 延伸时间决定于酶的反应速度和扩增片段长度。

  19. 实验操作 1 取一个0.2ml eppendorf管，添加以下各种成分反应液 ddH2O 11.8 µl 模板DNA 1 µl 上游引物(2.5µmol/L) 1.6 µl 下游引物(2.5µmol/L) 1.6 µl dNTP mixture(2.5mmol/L) 1.6 µl 10倍×缓冲液+ MgCl2 2 µl Taq酶 （2.5 U /ul） 0.4 µl 总体积 20 µl 2 稍作离心,将反应管放入PCR仪中。

  20. 3. 设定反应程序： 94℃条件下使模板DNA预变性3min。 变性 94℃ 30sec 退火 54℃ 30sec 30 cycles 延伸 72℃ 1min 30sec 最后在72℃条件进行延伸7-10min。 4 ℃保温 4. 取5 µl反应液用1%琼脂糖凝胶进行电泳,鉴定PCR产物是否存在以及大小。

  21. 1 2 3 M 4 5 PCR产物 的琼脂糖凝胶电泳 1，2，4，5：PCR产物；3，阴性对照；M，DNA分子量标准（从上向下：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp）

More Related