P olymerase C hain R eaction

PolymeraseChainReaction Lančana reakcija polimeraze

PCR PCR je tehnika kojom se mala količina specifičnogregiona DNK umnožava (amplifikuje), kako bi se mogla koristiti za dalja istraživanja i testiranja(DNK region može biti gen ili sekvenca).

PCR prajmeri • Sekvence koje se nalaze na oba kraja regiona DNK koji se ispituje • Neophodan je prajmer za svaku ciljnu sekvencu na kraju molekula DNK. • Na taj način mogu oba lanca da se istovremeno kopiraju u oba smera.

PCR prajmeri TTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTT (prvi lanac) AATTGCCGGAATT (prajmer) i (prajmer) TTTAAACCGGTT AATTGCCGGAATT. . . AAATTTGGCCAA (drugi lanac)

PCR prajmeri Prajmeri variraju od 15 do 30 nukleotida, sastoje se od jednog lanca i koriste se kao komplementarni gradivni elementi za ciljnu sekvencu.

PCR prajmeri Prajmeri se uvek dodaju u višku, kako bi se vezivali za ciljnu DNK, odnosno da se dva lanca ne bi ponovo međusobno povezala.

PCR denaturacija Denaturacija je prvi korak u PCR, u kojem se lanci DNK razdvajaju zagrevanjem do 95°C.

PCR povezivanje Povezivanje je proces kojim se dve sekvence DNK povezuju vodoničnim vezama. Povezivanje ciljne sekvence i prajmera se sprovodi hlađenjem reakcione smeše na 55°C.

PCR -Taq DNK polimeraza Taq je skraćenica od Thermus aquaticus - bakterija koji živi u termalnim izvorima u Yellowstone Nacionalnom parku, na temperaturi od oko 80°C.

PCR -Taq DNK polimeraza Taq proizvodi enzim DNK polimerazu, koja umnožava molekul DNK uz pomoć prajmera u procesu lančane reakcije polimeraze, u prisustvu Mg2+ jona.

PCR ciklusi

PCR ciklusi - pregled • Denaturacija: 94°- 95°C • Povezivanje prajmera: 55°- 65°C • Izduživanje DNK: 72°C • Broj ciklusa: 25-40

PCR - Šta je sve potrebno? • Magnezijum hlorid • dNTPs • Prajmeri • Taq DNK polimeraza • Ciljna DNK

PCR (50 ml) • 10xPCR pufer- 5 ml • 50mM MgCl2- 1.5 ml • 10mM dNTP Mix- 1 ml • - primer- 1 ml • + primer- 1 ml • DEPC H2O- 38 ml ________________________________ 47.5 ml • cDNK- 2 ml • Taq polimeraza- 0.5 ml

P olymerase C hain R eaction