MEHANIČKI DJELOVI MIKROSKOPA Postolje (podloga) Stativ (ručica) Tubus sa revolverom Stolić

1. MIKROSKOPI I MIKROSKOPIJA • osnovni cilj joj je da male predmete ili bliske detalje (tačke) veċih predmeta učini vidljivim • optička mikroskopija najveċim dijelom je vezana za percepciju pomoċu oko • MEHANIČKI DJELOVI MIKROSKOPA • Postolje (podloga) • Stativ (ručica) • Tubus sa revolverom • Stolić • Makrometarski i mikrometarski zavrtanj • Uređaj za osvjetljavanje • OPTIČKI DJELOVI MIKROSKOPA • Okular • Objektiv • Kondezor • Ogledalo • Blenda

2. Par okulara • Glava • Nosač • Postolje • Obrtna glava držača objektiva • 2 para objektiva • Disk za uzorke • Unutrašnja sijalica za propuštenu svjetlost • Sijalica za sporednu svjetlost • Držač okulara • Prekidač sa 3 pozicije • Stalak i točkić za fokusiranje • Gumeni dodaci na okularima • Uređaj za regulaciju dioptrije KONUS DIAMOND

3. priroda svjetlosti određuje granice uvećanja koje može biti postignuto svjetlosnim mikroskopom • sa danas savremenom opremenom opremom svjetlosnog mikroskopa posmatrani predmet se uvećava do 2000 puta, a dodatnom i do 3000 puta • moć razlučivanja tj. sposobnost da proizvede odvojene slike objekata koji su blizu jedan drugoga—ograničena je dužinom svjetlosnog zraka (za biološke uzorke 0.2 mm za SM,a 0.4nm za EM) • -strukture manje od 400 nm u prečniku ne mogu biti uočene svjetlosnim mikroskopom ako se upotrebljava dnevna svjetlost (upotreba lupe po pravilu ne može da uočava objekte manje od 80 m, sa rijetkim izuzetkom do 25 m)

4. SUVI SISTEM OBJEKTIVA • Svj zrak se prelama jer nema isti indeks refleksije kao staklo • MOKRI (ULJNO, IMRZIONI) SISTEM OBJEKTIVA • Svj zrak se ne prelama jer imerziona tečnost ima indeks refleksije blizu indeksa refleksije stakla

5. Dodaci (akcesorije) • Kondenzori za svijetlo i tamno polje • Fazno kontresni dodaci • Epi-fluorescentni dodaci • DIC (Differential Interference Cintrast) dodatak • Filter za polarizovanje svjetlosti • Modulator svjetlosti i par okulara (3D) • Sistemi koji omogućavaju da se konvencionalni SM toliko usavrše da rezultati budu slični EM - Scanning Probe Microscopy, Atomic Force Microscopy • Fotomikrografski sistem • Projekcioni ekran • Pokazivač • Tubus za crtanje • Dodatak za učenje • Mobilni mikroskopi za terenska istraživanja

6. - žive ćelije se mogu nekoliko časova posmatrati pomoću svjetlosnog mikroskopa održavanjem u odgovarajućoj sredini • pošto djelovi protoplasta imaju indeks prelamanja sličan indeksu prelamanja vode (savijaju svjetlosne zrake u istom stepenu kao i voda) mnogi detalji ćelijske građe ne mogu da se uoče u živim ćelijama • više detalja može da se uoči kada se ćelije ubiju u različitim mješavinama alkohola, sirćetne kiseline, hromne kiseline, formaldehida ili osmium-tetraoksida • - zatim se ubijeno tkivo potopljeno u parafin siječe na presjeke debljine 5 do 20 m---prenese na staklenu ploču i oboji ---detalji postaju mnogo jasniji

7. SVJETLOSNA (optička) MIKROSKOPIJA • FAZNO KONTRASNA MIKROSKOPIJA (FKM) • - pri prolašenju svjetlosnih talasa kroz objekat neki od njih će promijeniti pravac i biti zadržani bar za ¼ talasne dužine (difrakciono svijetlo) dok će drugi proći nepromijenjeni (direktno svijetlo), što se dešava zbog različitih indeksa prelamanja i različite debljine pojedinih tačaka objekta • - tamni ili svijetli fazni kontrast se postiže dodavanjem: • - prstenaste dijafragme u kondezor da bi smanjila osvjetljenje objekta • - difrakcione ploče koja se stavlja iza fokalne ravni objektiva gdje se odvajaju difrakcioni i direktni talasi • difrakcioni i direktni talasi teže poništenju jedni drugih, pa se objekat pojavljuje tamniji nego pozadina • Alternativna forma FKM je svijetli ili tamni FK kod koga su direktni svjetlosni talasi zadržani na nivou fokalne ravni objektiva; tako će direktni i difrakcioni talasi biti jednako zadržani pa imamo svijetao objekat na tamnoj podlozi • velika primjena u proučavanju nebojenih preparata

8. INTERFERENTNA MIKROSKOPIJA (IM) • Jedini direktan metod za mjerenje suve mase bioloških uzoraka • Može se mjeriti suva masa pojedinačne pokretne ćelije u kulturi tkiva • Svjetlost se dijeli na zrak koji prolazi kroz objekat i zrak koji ga obilazi , ta dva zraka se rekombinuju prije ulaska u okular • Ta razlika optičkog puta (OPD- optical path difference) može da se mjeri jer je OPD direktno povezana sa refraktivnim indeksom uzorka (koncentracija molekula (proteina, NK i itd nazvani suva masa) u tkivu može da se izračuna • Uvedena je 1893, 50-tih i 60-tih godina se široko upotrebljavala, kasnije smanjeno, a dabas se počela ponovo intenzivno koristiti uz kompjuterske sisteme za analizu podataka Centaurus FT-IR mikroskop vrhunskog kvaliteta omogucava istovremeno vizuelno i FT-IR snimanje uzoraka mikroskopske velicine. Fleksibilna konfiguracija omogucava mapiranje uzoraka, fluorescentno snimanje kao i disperzionu Raman spektroskopijuBrze analize, jednostavna upotreba (korisnik sam menja kristale)• 

9. POLARIZACIONA MIKROSKOPIJA (PM) • -između izvora svjetlosti i kondezora stavlja se polarizator (polarizer) koji će davati polarizovani zrak svjetlosti; a iznad ili ispod objektiva ubacuje se analizator (analyzer) • najbolja posmatranja se vrše na živim ćelijamaili na sječenom nefiksiranom, ili zamtrznutom nefiksiranom materijalu • primjena u biologji za ćelijske zidove, strukturu membrana, inkluzije • ULTRALJUBIČASTA APSORPCIONA MIKROSKOPIJA (UVM) • korišćenje UV svjetlosti umjesto bijele ima sledeće prednosti: • smanjenjem talasne dužine upotrebljene svjetlosti povećava se rezolucija • apsorpcija specifičnih talasnih dužina UV svjetlosti od strane određenih jedinjenje omogućava njihovu identifikaciju ako su mjerenje rađena prije i poslije ekstrakcije ili digestije tih jedinjenje (DNK, RNK i proteini) • Osnovne razlike SM i UVM: koristi se monohromatska UV svjetlost; kvarcni reflektujući kondezor; kvarcne pločice i pokrovna stakla; kvarcni objektiv; prizma umjesto ogledala (ovo je potrebno jer se kratki talasi filtriraju staklenim sistemom sočiva); potreban je i izvor vidljive svjetlosti jer oko ne može detektovati uzorke osvjetljene UV svjetlošću • Uv zračenje je letalno za žive ćelije, pa se proučava fiksirano tkivo ili presjeći nefiksiranog zamrznutog tkiva

10. FLUORESCENTNA MIKROSKOPIJA (FM) • razvija se početkom 20-tog vijeka, kad aje primjećeno da neki biološki molekuli fluoresciraju pri osvjetljavanju intenzivnim svjetlosnim zrakom određene talasne dužine • od 60-tig godina se intenzivno koristi u biologiji i medicini (npr antitijela), posebno u ćelijskoj biologiji zbog visoke osjetljivosti i rezolucije uz neinvazivni način detekcije • Mnoge komponente biljnih tkiva fluoresciraju kada se osvijele svjetlošću malih talasnih dužina, apsorbuju svjetlosnu energiju jedne talasne dužine i emituju je na talasnim dužinama pomjerenim ka crvenom dijelu spektra • Uvođenje epi-osvjetljenja (epi-fluorescencije), uzorak se osvjetljava direktno odozgo, pa svjetlo ne prolazi kroz ogledalo, kondezor ili uzorak pa se ne gubi na intenzitetu osvjetljenja (debljina presjeka sada nije bitna, jer se slika formira samo sa njegove površine) • Prednosti su što ista sočiva osvjetljavaju objekat i sakupljaju svjetlost sa njega, mikroskop je uvijek idealno podešen; ako se upotrijebe jača sočiva objektiva, automatski se povećava osjetljivost (iluminacija)

11. Fluorescencija se sastoji iz dvije forme: • Primarna – prirodna fluorescencija (autofluorescencija) tkivnih jedinjenja i u nekim slučajevima je izuzetno slaba • Sekundarna – postiže se bojenjem fluorescentnim bojama ili fluorohromom i obično je jača • zbog ograničenog broja biljnih tkiva koja fluoresciraju istraživači su počeli da koriste fluorohrome tj molekule koji fluoresciraju kada su vezani za određena jedinjena u biljnom tkivu • univerzalni fluorohrom za biljna tkiva je kalkofluor, koja postaju skora sva ledeno plava pod UV; auramine O vezuje se za lignin i kutin, fluorescira žuto; acridine orange, DAPI, ANSA i dr za određene ćel komp -nefiksirani, zamrznuti presjeci ili sječeni samo žiletom su idealni, jer mogu odmah da se posmatraju; potapanjem u rastvor boje omogućava se dobijanje detaljne slike ćelijske strukture a sam materijal se ne oštećuje fiksiranje i dehidratacijom; brzo se pregleda veliki broj uzoraka - Primjena u histohemiji, imunofluorescentnoj citohemiji, u inedtifikaciji NK, proteina, ugljenih hidrata i lipida reaktivnih sa fluorescentnim bojama, kao i za detekciju određenih jedinjena u biljkama zahvaljujući njihovoj primarnoj fluorescenciji kao što je kutin, hlorofil i lignin INVERTNI FM – ima objektive sa donje strane; omogućava sjajnije slike i veći kontrast; velika primjena u istraživanjima nataloženog materijala (u specijalnim komoricama) npr. u hidrobiologiji

12. KONFOKALNA MIKROSKOPIJA (KM) Principe konfokalne mikroskopije postavio je fizičar i konstruktor Marvin Minski kome od 1957. godine pripadaju patentna prava. Pojam konfokalan (eng. Confocal) je kovanica čije je poreklo složeno iz engleskog termina CONjugated FOCAL plane. Sredinom osamdesetih godina prošlog vijeka, kombinovanjem usavršenih računara, lasera i optike, dolazi do konstruisanja konfokalnih mikroskopskih sistema koji uprkos vrlo velikoj cijeni postaju šire primenjivani zahvaljujući svojim izuzetnim karakteristikama. Prvi konfokalni mikroskop predstavilo je preduzeće Bio-rad. Firma Carl Zeiss je nedavno otkupio i deo firme Bio-rad i tako postao vlasnik njihovih izuma na polju laserske tehnologije.

13. Dobijanje konfokalnih slika visoke rezolucije omogućeno je zahvaljujuci primeni lasera i analogno-digitalne konverzije koju podržava računarski sistem poslednje generacije. Laserski blok uređaja čine Argonski laser (sa nekoliko spektralnih linija: 457nm, 478nm, 488nm i 514nm) i Helijum-Neonski laser (543nm). Tako je omogućena ekscitacija fluorohorma (fluorescentnih indikator) koji apsorbuju svetlost u plavom i zelenom delu vidljivog spektra. Dvokanalno registrovanje emitovanog svetla je u opsegu od 475 nm preko zelenog i crvenog dela vidljivog spektra do IC svetla. Takođe upotrebom živine HBO-lampe moguće je dobiti signal sa fluorohorma koje zahtevaju UV ekscitaciju, kakav je DNK obeleživač DAPI 1. laserski zrak, kao tačkasti izvor kontrolisanog svjetlosnog intenziteta, se pomoću motorizovanih optičkih elemenata fokusira u bilo koju tačku vidnog polja 2. reflektovana svetlost ili emitovana fluorescencija sa uzorka usmeravaju se ka detektoru kroz minijaturni otvor («pinhol») te se tako propušta samo svjetlost koja dolazi iz tačke fokusa («princip konfokalnosti») 3. svjetlosni detektor (fotomultiplikator) mjeri intenzitet pristigle svjetlosti

14. Konfokalni mikroskop ima primenu u mnogim poljima biomedicinskih istraživanja jer pre svega obezbeđuje dobijanje jasnijih slika ćelija i tkivnih struktura koje su obeležene fluorohromima. Precizno usmeravanje laserskog zraka omogućava da intenzitet svetlosti ispred i iza ravni fokusa bude smanjen. Z-filter, odnosno "pinhole", određuje debljinu optičkog preseka iz kojeg potiče svetlosni signal i njime se reguliše konfokalnost dobijene slike. Tako je, kombinovanjem lasera, kontrolisane optike i z-filtera, moguće postići osvetljenje i snimanje emitovane svetlosti iz jedne tačke precizno određene u bilo kom delu zapremine preparata. Pomeranje («skaniranje») laserskog snopa svetlosti i kompjuterska obrada daju optički presek uzorka. Serija optičkih preseka upotrebom LSM softvera daje izgled preparata u tri dimenzije («3D rekonstrukcija»). Pri tome se redukuje zamagljenost u pozadini koja se dobija na epi-fluorescentnom mikroskopu i dobija slika visoke rezolucije.

15. Popularnost konfokalnog mikroskopa bazira se na jednostavnosti dobijanja slika izuzetno visokog kvaliteta sa uzoraka koji su pripremljeni za konvencionalnu mikroskopiju, kao i zbog primene u mnogim poljima savremenih biomedicinskih i biotehnoloških istraživanja Multifluorescencija dobijena konfokalnim mikroskopom je idealna za direktnu vizuelizaciju odnosa i interakcija molekula i drugih ćelijskih komponenti u njihovom prirodnom kontekstu. LSM 510 (Carl Zeiss) Axioskop 2 FS plus

16. Prednosti konfoklanog mikroskopa i posebno LSM 510 (Carl Zeiss): • - dobijanje jasnije slike u odnosu na konvencionalni fluorescentni mikroskop • - ne zahtijeva pravljenje tankih preseka uzoraka • - kompjuterski kontrolisan mikroskop sa finom kontrolom fokusa i digitalizacijom slike • - kolekcija seta podataka za rekonstrukciju objekta u tri dimenzije • mogućnost rada u «četvrtoj dimenziji» - za praćenje kinetike biohemijskih i fizioloških procesa «in vivo» u vremenu. • sposobnost kolekcije dve slike simultano sa uzorka obilježenog sa više fluorohroma (do 4 indikatora u istom preparatu) • - moguće je dobiti mikrografije i od preparata koji slabo fluoresciraju • Primjena : • u svim poljima biomedicinskih istraživanja • u farmaceutskoj industriji • u medicinskoj i stomatološkoj kliničkoj praksi i za dijagnostiku • u ispitivanjima materijala i različitih supstanci u industriji i biotehnologiji

17. Priprema uzorka i slikanje Procedure za pripremu i slikanje uzoraka na konfokalnom mikroskopu u biomedicinskim naukama su uglavnom preuzete iz standardnih tehnika za fluorescentnu mikroskopiju. Osim fluorescencije kao izvora signala moguće je registrovati refleksiju svetla sa površine optički "gustih" tela kakavi su: polen, hitinski omotač insekata ili raznovrsni nebiološki materijali.Bez obzira na protokol pripreme uzorka, osnovne prednosti načina na koji se koristi konfokalni mikroskop jesu: • fleksibilnost prikaza slike • - mogućnost analize detalja ćelijske i subćelijske građe u dve ili tri dimenzije • rad sa kolekcijama više digitalnih slika za 3D rekonstrukciju ili za dobijanje vremenskih serija fizioloških procesa “in vivo”

18. -Primjenom relativno jednostavnih protokola (najčešće imunohistohemijskih) na specifičan način moguće je obeležiti određene ćelijske strukture sa jednom ili više fluorescentnih proba - flurohroma. Postoji veliki broj ovakvih supstanci koje se mogu koristiti za vizulizaciju: -fiksiranih bioloških preparata -živih isečaka tkiva -ćelijskih kultura Mnoge fluorescentne probe, konstruisane oko aromatičnih hemijskih jedinjenja, napravljene su tako da: -obeležavaju biološke makromolekule (npr. proteine ili nukelinske kiseline) i time vizualizuju specifične strukture ili odeljke ćelije kao što su citoskelet, mitohondrije, Goldžijev aparat, jedro... -omogućavaju praćenje ćelijskog integriteta (žive ćelije u odnosu na mrtve i apoptotične), endocitoze, egzocitoze, membranske fluidnosti, kretanja proteina, signalne transdukcije ili enzimske aktivnosti -omogućavaju praćenje dinamičnih procesa vezanih za promene koncentracije neorganskih jona metala i elektrolita, pH, reaktivnih kiseoničnih vrsta, membranskog potencijala i dr. -imaju primenu u genetskom mapiranju i analizi hromozoma.

19. SCANNING PROBE MICROSCOPY (SPM) – omoguċava vizualizaciju povšinske topografije; kvantitativno sakupljanje podataka u 3 dimenzije; fleksibilnost u uslovima rada (nijesu potrebni uslovi vakuuma); efikasna uveċanja koja su dovoljna da razdvoje molekule i atome Agilent 5500 scanning probe microscope with Olympus IX71 inverted optical microscope http://www.physics.uoguelph.ca/psi/spm.shtml

20. SCANNING NEAR –FIELD OPTICAL MICROSCOPY (SNOM) – kombinacija SPM i OM; visoka rezolucija (ispod 100 nm), 3D topografija, visok kontrast, fluorescencija, spektroskopija; velika primjena u biološkim istraživanjima gdje su potrebni podaci na nm nivou npr. detekcija pojedinačnih molekula SCANNING TUNNELING MICROSCOPY (STM) – 1981. u Cirihu je dizajniran i napravljen prvi skening tunelski mikroskop koji je po prvi put omoguċio generisanje slika u pravom prostoru sa atomskom rezolucijom i bez korišċenja bilo kakve radijacije ili sočiva; omoguċio je detaljno otkrivanje prirode različitih površina na atomskoj skali; on je početan korak za nastajanje AFM

21. ATOMIC FORCE MICROSCOPY (AFM) – od nastanka 1986. AFM se razvila u vrijednu tehniku za vizualizaciju sa rezolucijom u opsegu od µm do sub nm, kao jedan od najmoċnijih alata za odredjivanje površinske topografije -omoguċava 3D vizualizaciju i mjerenje neobojenih struktura u vazduhu ili tečnostima na mikronskoj skali; olakšana je obrada širokog opsega materijala, uključujuċi proteine, lipide i DNK (može direktno da mjeri intermolekularne sile vezivanja, od protein-DNK interakcije do ċelijske morfometrije, do površine biomaterijala) - Dizajniran je za korišċenje zajedno sa invertnim OM; kombinuje svijetlo polje, fazni kontrast, fluorescentne, konfokalne, spektroskopske tehnike. AFM se kombinuje i sa Scanning Probe Microscopy i Scanning Near Field Optical Microscopy, čime se dobijaju mnoge prednosti za vizualizaciju bioloških supramolekulskih struktura ċelija i subċelijskih kompartmenta http://nano.mtu.edu/afm.htm

22. MIKROSKOPIJA X ZRACIMA – povećanje rezolucije skraćenjem talasne dužine je postignuto korišćenjem X zraka umjesti vidljive ili UV svjetlosti - Moguće studiranje uzoraka u vodenim medijima pa ima veliku primjenu u medicini, biologiji i fizici (može se koristiti za ispitivanje vlažnih nefiksiranih bioloških uzoraka i dr materijala, na rezoluciji višoj od većine SM i KF) http://www-cellbio.med.unc.edu/henson_mrm/pages/mrmfaq.htm • NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE (NMR) MIKROSKOPIJA – jedinstveno sredstvo za studiranje živih biljnih sistema u relaciji sa morfologijom, čije se prave karakteristike često gube tokom pripreme tkiva konvencionalnim metodama • Slike su sasmim drugaćijeg karaktera od slika dobijenih optičkim metodama, jer • Signal NMR slike dolazi od pokretnih jedinjenja (voda, ulje) dok se optička slika dobija od apsorbovane, rasute i reflektovane svjetlosti poslije interakcije sa čvrstim konstituentima (znači, optičke metode primarno daju slike strukture tkiva, a NMR vizuelizira tj mapira rastvore između struktura u tkivima)

23. ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA -Elektronski mikroskopje konstruisan u Njemačkoj 1932. god., a širu je biološku primjenu stekao je tokom ranih pedesetih -Umjesto vidljive svjetlosti i optičkih sočiva, elektronski mikroskop koristi snop elektona, koju usmjerava fokusirajući elektromagnetno polje -Iz razloga što je talasna dužina elektrona znatno kraća od one fotona vidljive svjetlosti, moċ razdvajanja elektronskog mikroskopa je puno manja od one kod svjetlosnog mikroskopa: oko 0,1 – 0,2 nm kod elektronskog mikroskopa 200 – 350 nm kod svjetlosnog mikroskopa Međutim, za biološke uzorke stvarna moċ razdvajanja obično nije niža od 2 nm ili je viša, zbog problema s pripremom preparata i kontrastom. Elektronski mikroskop ima oko 100 puta veću moć razdvajanja od svjetlosnog mikroskopa. Za posljedicu je i iskoristivo povećanje također veće: do 100 000 puta elektronskog mikroskopa, u poredjenju sa 1000 do 1500 puta kod svjetlosnog mikroskopa.

24. -prenosni (transmisioni) elektronski mikroskop (TEM) i skenirajući elektronski mikroskop (SEM). oba primjenjuju snop elektona, ali za stvaranje slike koriste različite mehanizme -TEM sliku oblikuje pomoću elektrona koji se projektuju kroz preparat -SEM, pak, skenira površinu preparata te sliku oblikuje otkrivajući elektrone koji se odbijaju od vanjske površine preparata. SEM je neobična tehnika zbog osjeċaja dubine koji se stiče posmatranjem prikazanih bioloških struktura. Glavna prednost je visoka snaga razdvajanja zahvaljujući elektronima sa veoma kretkom talasnom dužinom koji osvjetljavaju uzorak TEM

25. Sličnosti SM i EM: -elektronski pištolj (stvara elektrone koji se usmjeravaju u sistem sočiva )– lampa SM -kondezori usmjeravaju (fokusiraju) elektronski zrak (umjesto svjetlosnog) u uzorak • razlike: • Za razliku od SM elektromagnetno sočivo objektiva ima stalno uveċanje, ali je ono i najvažniji dio EM, odgovorno za rezoluciju EM; • ostala sočiva uveċavaju sliku sa objektiva i produkuju na ekran (obično dva sa promjenljivim uveċanjem); • sočiva i ekran se nalaze u vakuumu • Ekran (fluorescentni ili fosforescentni) je prekriven sulfidom, cinkom ili kadmijumom koji emituju svjetlost proporcionalno broju elektrona EM se sastoji od: mehaničke konstrukcije, električnog sistema i vakuum sistema.

26. SEM http://science.howstuffworks.com/scanning-electron-microscope.htm http://www.inano.au.dk/research/competences-and-facilities/nanotools/transmission-and-scanning-electron-microscopy/ http://www.vcbio.science.ru.nl/en/image-gallery/show/PL0337/ (hlorplasti)

27. Specifične tehnike u elektronskoj mikroskopiji • -tehnika negativnog bojenja -uzorci se ne režu na ultratanke presjeke već se stavljaju u gustu elektronsku boju, omogućavajući netaknutom preparatu da sliku stvori izdvajajući se od tamno obojene pozadine (primjenjiva isključivo na vrlo male predmete poput virusa ili izolovanih organela, ali omogućava da se izgled oblika i površine proučava na još uvijek netaknutim predmetima) • frakturisanje zamrzavanjem - preparati se podvrgavju naglom zamrzavanju – obično u tečnom azotu – a onda se udaraju oštrim rubom sječiva. Ovo uzrokuje lomljenje (frakturu) preparata po linijama prirodne slabosti, što su u većini slučajeva prazni prostori u membranama. • Tanki sloj zlata ili platine sa zgusnutim elektronima, se tehnikom "zasjenjivanja" nanosi na površinu uzorka stvarajući kopiju preparata od zlata ili platine. Kopija se potom proučava TEM-om. Iz razloga što linija loma prolazi kroz prazne prostore u membranama gdje god je to moguće, kopija nastala ovim postupkom je vjeran prikaz unutrašnjosti membrana. Proučavanje uzoraka frakturiranja zamrzavanjem je u velikoj mjeri pridonijelo razumijevanju građe membrana.