Dronpa Studie en simulatie van het fluorescente proteïne Dronpa en zijn mutanten

1. Analyse simulaties Toepassingen Dronpaconcreet[1,2] Referenties DronpaStudie en simulatie van het fluorescente proteïne Dronpa en zijn mutanten Ellen Bertels*, Nathalie Busschaert Geïntegreerd Projectpracticum, 3e Bachelor Chemie, K.U.Leuven, Departement Chemie, Celestijnenlaan 200F, B-3001 Leuven (Heverlee). E-mail: ellen.bertels@student.kuleuven.be Kristalstructuur Discussion • Dron is een ninjaterm die verwijderen betekent, Pa staat voor PhotoActivation. • Dronpa, bestaande uit ongeveer 238 aminozuren, is een variant van GFP (Groen Fluorescent Proteïne), waarvan de fluorescentie aan- en afgelegd kan worden met behulp van licht. • ● aanleggen gebeurt met UV-licht (405 nm) • ● afleggen gebeurt met blauw licht (488 nm) • Dit aan- en afleggen kan meer dan 100 x herhaald worden. • Dronpa is in verscheidene toepassingen terug te vinden: • ● in opto-elektronische toestellen (equivalent aan digitale bit) • ● bij het van volgen celprocessen • ● bij niet-diffractie gelimiteerde microscopie • Dronpaalsmonomeer is opgebouwduit: • ● een barrel bestaandeuit • β-sheets • ● het chromofoor • (Cys62-Tyr63-Gly64) • Het chromofoor zit vast • door H-bruggen enπ- • stacking met His . • De barrel isvrijstar door • packing van de β-sheets • Het chromofoor zit goed • ingebed in de barrel en is • afgeschermd van het • solvent. Ditleidt tot een • hogekwantumopbrengst! • Men gebruikt dronpa in niet-diffractie gelimiteerde microscopie door het via genetische manipulatie aan cellen van het bestudeerde species vast te hechten. Zo ontstaat niet-destructieve microscopie. Visualisatie van de cellen gebeurt met behulp van PALM[3] (photo activation localization microscopy). • Ditwordttoegepastop single-molecule preparaten en dierlijke COS7-cellen. Men werkt steeds met eensterkverdundeoplossingvooreenduidelijkgeresolveerdbeeld van de Single Molecules. • Na het wegfiltreren van de achtergrond bepaalt men de plaats van de dronpamoleculen op verschillende tijdstippen. Combinatie van deze plaatsbepalingen leidt tot een beeld met hoge resolutie. • Onzebekomenresolutie is 50 nm en kannogbeter! De cis-vorm van het chro- mofoor is gedeprotoneerd, waardoor de elektronen beweeglijkzijn. Dit is dus de fluorescentevorm. Het trans-isomeervormt de dark state, aangezien het neutraal is, en de elek- tronen minder bewegen. Aan- en afleggen van de fluorescentiegaatgepaard met cis-trans isomerisatie. Hierbij veranderen τ en Φ gelijkaardig en geeft vooral Phe173 sterische hinder, waardoor mutaties hiervan interessant zijn. Deze mutaties hebben vooral een invloed op de trans-vorm. ● Door mutatie naar een kleinere groep vergemakkelijkt de rotatie naar het cis-isomeer. ● Mutatie naar een groter residu zoals Trp geeft een tragere mutant. [1] Stiel et al., (2007), Biochemical Journal, 402, 35-42 [2] Habuchi et al., (2005), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 9511-9516 [3] Dedecker et al., (2007), Angew. Chem. Int. Ed., 46, 8330-8332