1 / 41

Critically Appraised Topic : PRV-1 gen “Een nieuwe moleculaire merker voor Polycythemia Rubra Vera”

Critically Appraised Topic : PRV-1 gen “Een nieuwe moleculaire merker voor Polycythemia Rubra Vera”. Danielle Van der beek Assistent klinisch biologie UZ-Leuven 14-12-2004. Inhoud. Polycythemia Rubra Vera Symptomen Diagnose

adamdaniel
Download Presentation

Critically Appraised Topic : PRV-1 gen “Een nieuwe moleculaire merker voor Polycythemia Rubra Vera”

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Critically Appraised Topic:PRV-1 gen “Een nieuwe moleculaire merker voor Polycythemia Rubra Vera” Danielle Van der beek Assistent klinisch biologie UZ-Leuven 14-12-2004

  2. Inhoud • Polycythemia Rubra Vera • Symptomen • Diagnose • PRV-1 gen overexpressie: een nieuwe moleculaire marker voor Polycythemia Rubra Vera • PRV-1 gen en RQ-PCR • Critical Appraisel • Analytische performantiekarakteristieken • Diagnostische performantiekarakteristieken • Klinische impact • Organisatorische impact • Kostprijs • Decision making

  3. 1. Polycythemia Vera Rubra of Ziekte van Vacquez

  4. PolycythemiaRubra Vera • Myeloproliferatieve ziekte • Verworven mutatie van een hematopoëtische pluripotente stamcel • Afwijkingen in de drie mergreeksen • Klassiek onderscheidt men (FAB): • Polycythemia Rubra Vera • Essentiële trombocytose • Myelofibrose • Chronische myeloïde leukemie

  5. Symptomen • 6e – 7e levensdecade, Incidieus • Hyperviscositeit: hoofdpijn, duizeligheid, visusstoornissen, neusbloedingen, diffuse pijnen in de ledematen en abdomen • Tromboseneiging (perifeer + centraal) • Jeuk • Plethora • Splenomegalie • Bloedingen (GI)

  6. Diagnose (1) Verhoogde rode bloedcel massa • Absolute of relatieve erytrocytosis? • HTC > 56% (♀) of 60% (♂): PV na uitsluiten secundaire oorzaken (PVSG) • Hb > 16,5 g/dL (♀) of 18,5 g/dL (♂): major criterium (WHO) Heike L Pahl, Diagnostic approaches to polycythemia vera in 2004, Expert Rev. Mol. Diagn. 4(4), 2004

  7. Diagnose (2) Primaire of secundaire polycytemie? Carboxyhemoglobine gehalte? UpToDate Online version 12.2 (2004)

  8. Diagnose (3) • EPO dosage • Relatief eenvoudig - CHU Sart TilmanLuik • Laag erytropoëtine gehalte: primaire erytrocytosis • Hoog erytropoëtine gehalte: secundaire erytrocytosis • Beenmergkweek: • Autonoom in vitro laten groeien van endogene erytroïde koloniën (EEK’s) • Omslachtig, arbeidsintensief, moeilijk te standaardiseren, niet kosten-effectief • Morfologisch onderzoek van het beenmerg: • Weinig zinvol, enkel in DD. andere myeloproliferatieve ziekten • Geen criterium voor diagnosestelling van PV

  9. Diagnose (4) • Histologisch onderzoek van beenmergbiopt: • Kan diagnose van PV bevestigen • ↑ aantal grote megakaryocyten in clusters, proliferatie van de 3 mergreeksen met vooral proliferatie van de erytropoïese hyperplasie van gedilateerde sinussen • Cytogenetische afwijkingen: • Slechts in 10 – 20% afwijkend • Bewijs klonale aandoening

  10. Diagnose (5) Gemodifieerde PVSG-criteria volgens Berlin (2000) WHO. Tumors of the Hematopoietic and lymphoid tissues. IARC Press, Lyon, France (2001)

  11. Diagnose – nieuwe testen (6) • Verminderde expressie van de TPO receptor (c-Mpl) in plaatjes en megakaryocyten[Moliterno et al] • Proliferatie van plaatjes in PV is onafhankelijk van TPO, cfr. RBC – epo • Mbv. ELISA platelet-rich plasma (PRP) serotonine levels meten in pt met myeloproferatieve aandoeningen: lagere levels in patiënten met PV, ET en myeloïde metaplasie in vergelijking met secundaire polycytemie en controle patiënten • Overexpressie van PRV-1 mRNA

  12. 2. PRV-1 gen “Een nieuwe moleculaire merker voor Polycythemia Rubra Vera”

  13. 2.1. PRV-1 gen en RQ-PCR

  14. PRV-1 gen? • PRV-1 mRNA overexpressie in de granulocyten van perifeer bloed bij PV i.t.t. SE, CML, AML In fysiologische toestand expressie in het beenmerg perifeer bloed, geen beenmerg! • PRV-1 proteïne levels verschillen niet tussen PV en gezonde personen geen flowcytometrie, geen ELISA • PRV-1 gen • Behoort tot de uPAR/Ly6/CD39 receptoren • Chromosoom 19 band region q13.12-2 • Overexpressie mogelijks door aberrante transcriptie, geen structurele wijziging van het gen • Rol in de pathofysiologie van PV?

  15. Principe real-time PCR • Oligo dT primer bindt mRNA • RT maakt 1e streng cDNA aan • RT heeft endo H aktiviteit • Dubbelstrengs cDNA

  16. Principe real-time PCR • Denaturatie = splitsen van ds cDNA (95°) • Annealing = binden van de primers (60°) • Extension = vormen van een complementaire cDNA-streng mbv Taq-polymerase (60°) R Q Real-time PCR: fluorofoor gelabelde probe!

  17. R Q • Probe bestaat uit 5’ reporter label en een 3’ quencher label • Probe wordt afgebroken door de 5’ nuclease aktiviteit van het Taq- polymerase => fluorescentie ↑ • Ontstaan van 2 nieuwe identieke ds cDNA ketens • Opnieuw denaturatie, annealing,

  18. R R Q Q R R Q Q • extension, denaturatie, annealing, … • Exponentiële vermenigvuldiging van de gewenste DNA-sequentie

  19. Afbraak van de probe => R komt vrij => toename in fluorescentie, uitgedrukt in CT-waarde • De CT-waarde (cycle treshold) is die cyclus waarbij een bepaalde drempelwaarde voor fluorescentie overschreden wordt • Kwantitatieve bepaling: aan de hand van een IJKLIJN met standaard DNA en CT-waarden

  20. Standaardcurve (1) • Met behulp van een plasmide: • 4018 Kbp lang • Bevat fragmenten van het PRV-1 gen en het house-keeping gen GAPDH (Dr. M.R. Veldwijk, German Cancer Research Center, Heidelberg) • Plasmide transformatie naar E. coli DH5α, dan amplificatie • Plasmideconcentratie meten in het lysaat • Lineariseren van het plasmide • Dn concentratie geknipt plasmide meten • M.b.v. MW : aantal kopieën plasmiden berekenen • GUS (ß-glucuronidase): commerciële kit

  21. Standaardcurve (2) • Seriële standaardreeks: • 103 kopieën/5µL • 104 kopieën/5µL • 105 kopieën/5µL • Na uitvoeren PCR: aantal kopieën t.o.v. CT-waarde • Standaardcurve voor GUS • Standaardcurve voor PRV-1 • Elk staal (in triple): • Aantal kopieën PRV-1 • Aantal kopieën GUS => Ratio kopieën PRV-1/GUS

  22. 2.2. Appraisal

  23. Clinical bottom line • Kwantitatieve analyse van PRV-1 mRNA expressie met behulp van ‘real-time polymerase chain reaction’ is nuttig bij de diagnose van Polycythemia Rubra Vera of ziekte van Vacquez. • De nieuwe parameter kan gebruikt worden bij patiënten met erytrocytosis, gestegen hematocriet en/of gestegen hemoglobine voor de differentiële diagnose tussen primaire en secundaire erytrocytosis.

  24. 1. Analytische performantiekarakteristieken • Pre-analytische variabelen • Perifeer bloed, EDTA-staal • Flebotomie, hydroxyurea en interferon-α hebben een invloed op PRV-1 overexpressie • Bij pt met erytrocytosis moet een infectieus probleem uitgesloten worden alvorens PRV-1 expressie te gebruiken bij de diagnosestelling • Staalstabiliteit: RNA extractie / aanmaken van cDNA gebeurt best binnen de 24u

  25. 2. Analytische parameters • intra-assay variatie: • Elk staal wordt in triple uitgevoerd • Het gemiddelde van het aantal cDNA kopieën, corresponderend bij de respectievelijke CT waarden, wordt gebruikt voor de PRV-1/GUS ratio • Gemiddelde intra-CV (%CT) (n = 23): 0,83% • 1,27% voor PRV-1 • 0,39% voor GUS

  26. inter-assay variatie: • Bij elke run wordt er een standaardcurve gemaakt m.b.v. een plasmide • Voor 5 runs: CV’s van de CT’s voor 1000, 10000 en 100000 kopieën/5µL

  27. Accuraatheid (bias):afhankelijk van accuraatheid van de standaarden. Het opstellen, synthetiseren, zuiveren en kalibraties van DNA standaarden is van belang • Vergelijking met EPO dosage (n = 16): • Sensitiviteit PRV-1 100%, specificiteit PRV-1 100% • Groot aantal stalen met normaal EPO gehalte! • Prijs EPO: 17 € Prijs PRV-1 expressie: +/- 105 €

  28. Lineariteit: correlatiecoëfficiënt Binnen de range van 1 tot 1.106: lineair verband tussen log cDNA en de CT waarden. • Referentie range: • ≥ 130: PV bevestigen! (TO DO) • < 130: geen PV • Analytische range: Rekening gehouden met de amplificatie limiet (betrouwbaar vanaf 50 kopieën), is het analytische bereik 20 tot 40 CT’s. • Turn around time (TAT):max. 1x/maand en min. 1x/2 maanden

  29. Inschatting van het aantal te verwachten aanvragen • a.d.h.v. EPO dosage: • 51 aanvragen in 2003 • 48 aanvragen in 2004 (jan-okt) • 52 aanvragen verkregen, waarvan 9 uit de periferie (17%) • Kwaliteitscontrole: doel = de reproduceerbaarheid van de PCR bevestigen. • IQC: Het plasmide met zijn verdunningen is een controle op de verschillende stappen van de PCR Bij elke PCR moet de efficiëntie hetzelfde zijn E=10(-1/slope)-1 • EQC: (nabije?) toekomst

  30. 2.Diagnostische performantiekarakteristieken M. Bossuyt, “Towards complete and accurate reporting of studies of diagnostic accuracy: The STARD initiative.” Clin. Chemistry 2003;49:1,1-6

  31. PV Niet-PV

  32. Diagnostisch aspect: • nut bij diagnose PV (DD. prim/sec erytrocytosis) • Evt. EPO dosage en/of EEK’s vervangen • Cytologie levert geen meerwaarde op in de diagnostiek van PV (tenzij DD. myeloproliferatieve ziekte) • Botboorbiopsies: richtinggevend • cytogenetica: minderheid + • Behandeling: • interferon: down-regulatie van PRV-1 expressie • PRV-1 expressie: merker voor klinische respons? • Health outcome: juiste diagnosestelling! In de literatuur (nog) geen evidentie dat PRV-1 gen bepaling de outcome verbetert • Prognose en follow-up: / 3. Klinische impact

  33. 4. Organisatorische impact • Impact in het ziekenhuis: • Beenmergcytologie is geen criterium. Morfologisch onderzoek vergt +/- 1 uur werk voor MLT/GSO-ASO/supervisor • Beenmergkweek is tijdrovend en kostelijk. Momenteel wordt het enkel uitgevoerd bij twijfel over de diagnose (http://intranet/patientenzorg/procedures.protocols.html) • Er is geen verkorting hospitalisatieduur (meestal ambulante setting) • Is PRV-1 geïncorporeerd in klinische richtlijnen of guidelines? H. L. Pahl “Diagnostic approaches to polycythemia vera in 2004” Expert Rev. Mol.Diagn., 2004;4(4) • ‘European Leukemia Network’ zal binnen enkele maanden guidelines publiceren voor de standaardisatie van het RQ-PCR assay • Voorstel PVSG criteria verder aan te passen

  34. Diagnose PV: A1 + A2 + A3 of A4 A1 + A2 + twee B’s H. L. Pahl “Diagnostic approaches to polycythemia vera in 2004” Expert Rev. Mol.Diagn., 2004;4(4)

  35. 5. Kostprijs: binnen en buiten het labo • Actuale kost Rekening houdend met de reagenskost, distributiekosten, primaire en secundaire activiteiten: 105 € per patiëntenstaal in batch van 10 stalen • Terugbetaling CMD’s ontvangen een ‘enveloppe’, geen RIZIV tussenkomst • Voordeel elders in het ziekenhuis • PRV-1 kan EPO dosage vervangen • PRV-1 expressie + EPO dosage kan beenmergkweek vervangen (moeilijke standaardisatie, arbeidsintensief, niet kosten-effectief) • RBC-massa bepaling is niet steeds nodig (volgens clinici routinematig aangevraagd) – HTC > 56% (♀), HTC > 60% (♂) => PV (PVSG) – Hb > 16,5 g/dL (♀), Hb > 18,5 g/dL (♂) : major criteria volgens WHO

  36. 6. Decision making • Impact van PRV-1 op het klinisch beslissing proces • VOORSTEL DIAGNOSEREGEL: • Klinische vermoeden van PV Uitsluiten ET ! • HTC > 52 % (♂), HTC > 48 % (♀) (uptodate) • HTC > 50% (♂), HTC > 48% (♀) (http://intranet/patientenzorg/procedures.protocols.html) • Beenmergmorfologie is een overbodig onderzoek • RBC massa bepaling is niet steeds nodig • Past de test binnen het eigen labo profiel? • De test staat volledig op punt. De PCR is gelijkaardig aan andere real-time PCR’s: minimum aan opleiding MLT • Lage frequentie test: uitvoeren indien er tijd is • Stalen opsturen naar ander labo: verlies kwaliteit (cfr. Stabiliteit!) • Besluit: flowchart

  37. Vermoeden PV WHO Trombocytosis (> 400 x 109/l) WBC (> 12 x 109/l) Splenomegalie (klinisch/echo) Gestegen hematocriet / hemoglobine STAP 1 DD Absolute of relatieve erytrocytose? STAP 2 PVSG WHO * HTC > 56% vrouw HTC > 60% man Hb > 16,5 g/dl vrouw Hb > 18,5 g/dl man Relatieve erytrocytose: diurectica, dehydratatie, vochtsequestratie Ja: stap 3 Neen: RBC-massa bepalen STAP 3 Absolute erytrocytose: secundaire of primaire erytrocytose? • zuurstofsaturatie: gedaald • carboxyhemoglobinegehalte verhoogd: rookstop 3-4m • PRV-1 expressie • botbiopsie • cytogenetica • (EPO) • (beenmergkweek) *Dit criterium is minder streng aangezien 18,5 g/dl en 16,5g/dl ongeveer overeenkomt met een hematocriet van 54 en 48

  38. TO DO / ACTIONS • Reëvalutie cut-off • Opstellen van een werkvoorschrift indien de test in de routine komt • Aanvragers uit periferie verwittigen voor staalstabiliteit

  39. Dank u voor uw aandacht! Speciale dank aan: Dr. N. Boeckx Dr. J. Frans Frans Houtmeyers Prof. F. Van Stapel

More Related