PRZEWIDYWANIE STRUKTURY ORAZ FUNKCJI BIAŁKA SPOIIP.

1. PRZEWIDYWANIE STRUKTURY ORAZ FUNKCJI BIAŁKA SPOIIP. Student: JOLANTA OSIŃSKA Promotor pracy: prof. dr hab. Andrzej Koliński Opiekun pracy: dr Krzysztof Ginalski ABSTRAKT Białko SpoIIP (gi|16079607) to białko biorące udział w drugiej fazie sporulacji u Bacillus subtilis.Jednak jego mechanizm działania oraz struktura są nieznane. Poprzez wykorzystanie metody Meta-BASIC ustaliłam, że białko SpoIIP należy do klasy α/β białek o charakterystycznym foldzie zdefiniowanym w bazie SCOP jako phosphorylase/hydrolase-like. Jest członkiem nadrodziny egzopeptydaz cynkowych. Jego C-terminalna domena prawdopodobnie wykazuje aktywność enzymatyczną i charakteryzuje się rdzeniem typowym dla enzymów z rodzinyN-acetylomuramino-L-alanino amidaz, do których należą białka CwlV (pdb|1jwq)oraz PlyPSA (pdb|1xov). Centrum aktywne białka SpoIIP koordynuje kation cynku przez 4 aminokwasy: HIS189, GLU192, HIS279, GLU359 i odpowiedzialne jest za wiązanie substratu – peptydoglikanu. Zostało pokazane, że białko SpoIIP wykazuje aktywność hydrolazy peptydoglikanowej. Przejawia się ona w modyfikacji peptydoglikanu, który oddziela presporę od komórki matczynej w procesie sporulacji zachodzącym u Bacillus subtilis. Stopniowe rozluźnianie struktury peptydoglikanu przez hydrolizę jego wiązań peptydowych powoduje w końcu jego degradację, a więc daje tym samym możliwość całkowitego otoczenia prespory przez komórkę matczyną, co prowadzi później do uwolnienia spory do środowiska. Możliwe jest, że białko SpoIIP wraz z białkami SpoIID i SpoIIM (DMP) wspiera migrację błony matczynej komórki wokół prespory. Ta funkcja nie jest jednak potwierdzona i wymaga z pewnością istnienia innych niezidentyfikowanych białek, które generują siłę konieczną do poruszenia błony matczynej komórki. FUNKCJA ENZYMATYCZNA BIAŁKA SPOIIP Proces sporulacji u Bacillus subtilis wywołany jest przez niedobór składników pokarmowych i obejmuje podział rozwijającej się komórki na dwie komórki potomne, które znacznie się różnią wielkością. Większa komórka jest nazwana matczyną, mniejsza komórka nazwana jest presporą (ang. forespore). Zprespory powstaje spora. Obie komórki oddzielone są od siebie polarną przegrodą zbudowaną głównie z peptydoglikanu. Ostatecznie prespora zostaje otoczona przez błonę komórki matczynej i rozwija się w sporę. Matczyna komórka ułatwia przekształcenie prespory w sporę i następnie ulega lizie uwalniając sporę do środowiska [6]. Sporulujące komórki wykazują potencjał do tworzenia polarnych przegród na obu biegunach. Jednak podczas formowania spory powstawanie jednej z przegród musi być zahamowane. Białko SpoIIP łącznie z białkami SpoIIM i SpoIID (DMP) zapobiega formowaniu się drugiej przegrody. Białko SpoIIP wykazuje również aktywność hydrolazy peptydoglikanowej i tym samym odgrywa główną rolę w modyfikacji peptydoglikanu, który oddziela presporę od komórki matczynej [7]. Możliwe jest, że kompleks DMP wspiera migrację błony matczynej komórki wokół prespory. Ta funkcja nie jest jednak potwierdzonai wymaga z pewnością istnienia innych niezidentyfikowanych białek, które generują siłę konieczną do poruszenia membrany matczynej komórki [8]. Struktura peptydoglikanu u Bacillus subtilis jest zmiennym kopolimerem N-acetyloglukozoaminy (GlcNAc) i kwasu N-acetylomuraminowego (MurNAs) z pentapeptydowymi łańcuchami bocznymi MurNAs.Taka struktura pozwala na hydrolizę różnego typu wiązań, w zależności od specyficzności białek. Z definicji egzopeptydaz wynika, że odcinają one pojedyncze aminokwasy od końców łańcucha peptydowego.Możliwe jest zatem, że białko SpoIIP hydrolizuje wiązanie amidowe pomiędzy MurNAs i L-Alaniną znajdującą się w łańcuchu bocznym peptydoglikanu. Nie wiadomo jednak jaki jest mechanizm reakcji hydrolizy [9].Ustaliłam, że możliwe jest, że karbonylowy tlen wiązania amidowego z peptydoglikanu koordynuje z kationem cynku białka SpoIIP przyspieszając rozpad wiązania amidowego w peptydoglikanie. Dwa kwasy glutaminowe białka spoIIP (Glu192 i Glu359) mogą odgrywać rolę nukleofili lub mogą katalizować późniejszy etap reakcji. Jednak, żeby to potwierdzić należy przeprowadzić eksperymenty biochemiczne. Rys.1. Ustawienie sekwencji białka SpoIIP oraz jego wybranych homologów do sekwencji katalitycznej domeny CwlV (pdb|1jwq) orazN-terminalnej domeny PlyPSA (pdb|1xov). Sekwencjom przypisane są numery identyfikacyjne gi (ang. gen identification number)zgodne z bazą danych NCBI (ang. National Center For Biotechnology Information) lub kody białek z bazy PDB (ang. Protein Data Bank). Sekwencjom przypisane są również skróty nazw organizmów, są to odpowiednio: Am, Alkaliphilus metalliredigenes; Bcl, Bacillus clausii; Bcs, Bacillus cereus subsp. Cytotoxis; Bh, Bacillus halodurans; Bl, Bacillus licheniformis; Bm, Bacillus megaterium; Bs, Bacillus subtilis; Cd, Clostridium difficile; Ch, Carboxydothermus hydrogenoformans; Ho, Halothermothrix orenii; Mt, Moorella thermoacetica; St, Symbiobacterium thermophilum; Te, Thermoanaerobacter ethanolicus; Tt, Thermoanaerobacter tengcongensis. Numery pierwszych oraz końcowych aminokwasów napisane są odpowiednio przed i po każdej sekwencji, w nawiasach kwadratowych podana jest całkowita długość sekwencji. Liczby aminokwasów wykluczonych z ustawienia znajdują się w nawiasach zwykłych. Aminokwasy zachowane wśród rodziny SpoIIP są oznaczone według schematu: nienaładowane, żółte tło; polarne lub nienaładowane, szare tło; małe, czerwone litery. Aminokwasy kluczowe dla aktywności katalitycznej są oznaczone białymi literami na czarnym tle. Elementy struktury drugorzędowej znajdują się powyżej odpowiednich aminokwasów w sekwencji (E oznacza β-nić, H α-helisę). Dla SpoIIP (gi|16079607) elementy struktury drugorzędowej odpowiadają predykcji programu PSI-PRED.DlaCwlV struktura drugorzędowa wyznaczona jest krystalicznie. NARZĘDZIA I METODY W celu znalezienia członków rodziny SpoIIP użyłamprogramu PSI-BLAST[1]z sekwencją konsensusową rodziny jako zapytaniem. W wyniku otrzymałam 69 homologów, które głównie należały do bakterii. Ustawiłam ich sekwencje za pomocą programu PCMA[2]. Otrzymane homologi utworzyły rodzinę białek SpoIIP. Do znalezienia wzorców, do których porównywałam sekwencje rodziny białek SpoIIP, użyłam metaserwera Meta-BASIC[3]. Metodą 3D-Jury[4], metaserwer zmapował sekwencję przedstawiciela rodziny (białka SpoIIP) na białka o znanych strukturach. Najwyższe scory miały białka CwlV (pdb|1jwq) z Paenibaciluus polymyxa oraz PlyPSA ( pdb|1xov) z Listeria monocytogenes bacteriophage psa. Oba białka należą do klasy hydrolaz, które charakteryzują się znanym foldem zdefiniowanym z bazie danych SCOP jako phosphorylase/hydrolase-like, do nadrodziny egzopeptydaz cynkowych. Dobrze zachowane elementy struktury drugorzędowej, charakteryzujące ten fold,są obecne w strukturach obu białek. Dodatkowo białka szablony należą do jednej rodziny N-acetylomuramino-L-alaninoamidaz. Porównanie elementów struktury drugorzędowej N-terminalnej domeny białka PlyPSA odpowiedzialnej za aktywność enzymatyczną oraz katalitycznej domeny białka CwlV pokazało aminokwasy kluczowe dla aktywności enzymatycznej obu białek. Białko SpoIIP nie ma domeny odpowiadającej C-terminalnej domenie białka PlyPSA, odpowiedzialnej za budowanie ścian komórkowych[5]. Elementem zasadniczym w znalezieniu struktury białka SpoIIP było wyszukanie jego elementów zachowanych i aminokwasów kluczowych dla aktywności enzymatycznej. Poprzez porównanie sekwencji przedstawiciela rodziny ze strukturami wzorców ustaliłam, że białko SpoIIP i jego homologi są hydrolazami należącymi do nadrodziny egzopeptydaz cynkowych. PODSUMOWANIE W swojej pracy zastosowałam teoretyczne metody przewidywania struktury białek. Metody te są obecnie szeroko stosowane, ponieważ umożliwiają poprawną predykcję struktury na podstawie sekwencji białka. Opierają się na hipotezie, że cała informacja niezbędna do przyjęcia przez białko jego struktury natywnej dla danych warunków jest zakodowana w jego sekwencji.Metody te umożliwiają scharakteryzowanie bardzo wielu sekwencji, których liczba sięga obecnie 3 milionów (baza danych NCBI). Nie wszystkim sekwencjom będą przypisane struktury za pomocą metod eksperymentalnych.Warto wspomnieć, że liczba znanych struktur białek jest zdecydowanie mniejsza od liczby sekwencji, wynosi około 43 tysięcy (baza danych PDB). Funkcja białka jest zdeterminowana przez jego strukturę trzeciorzędową, więc od poprawnej predykcji struktury zależą dalsze analizy. Białko SpoIIP wraz z homologami znalezionymi PSI-BLASTem zaklasyfikowałam do nadrodziny egzopeptydaz cynkowych, które hydrolizują wiązania peptydowe substratów. Obecność kluczowych aminokwasów centrum aktywnego białka SpoIIP dodatkowo potwierdziła jego przynależność do rodziny N-acetylomuramino-L-alanino amidaz. Amidazy te są bardzo szeroko rozpowszechnione w żyjących organizmach i odgrywają ważną rolę w cyklach komórkowych, jednak ich charakterystyka enzymatyczna jest bardzo mało znana. • LITERATURA • Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., Lipman, D. J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research, 25, 3389-3402. • Pei, J., Sadreyev, R., Grishin, N. V. (2003) PCMA: fast and accurate multiple sequence alignment based on profile consistency. Bioinformatics, 12, 19(3):427-8. • Ginalski, K., Grotthuss, M., Grishin, N. V., Rychlewski, L. (2004) Detecting distant homology with Meta-BASIC. Nucleic Acids Research, 32, 576-581. • Ginalski, K., Elofsson, A., Fischer, D., Rychlewski, L. (2003) 3D-Jury: a simple approach to improve protein structure predictions.Bioinformatics, 19, 1015-1018. • Korndorfer, I. P., Danzer, J., Schmelcher, M., Zimmer, M., Skerra, A., Loessner, M. J. (2006) The crystal structure of the bacteriophage PSA endolysin reveals a unique fold responsible for specyfic recognition of Listeria cell walls. Mol. Biol., 364, 678-689. • Eichenberger, P., Fawcett, P., Losick, R. (2001) A three-protein inhibitor of polar septationduring sporulation in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol., 42, 1147-1162. • Dworkin, J., Losick, R. (2005) Developmental commitment in a Bacterium.Cell, 121, 401-409. • Broder, D. H., Pognaliano, K. (2006) Forespore engulfment mediated by a ratchet-likemechanism. Cell, 126, 917-928. • Smith, T.J., Blackman, S. A., and Foster, S. J. (2000) Autolysins of Bacillus subtilis:multiple enzymes with multiple functions. Microbiology, 146, 249-262. STRUKTURA BIAŁKA SPOIIP W wyniku analiz, ustaliłam że C-terminalna domena białka SpoIIP wykazuje aktywność enzymatyczną. Jej rdzeń składa się z 6 -nici, które otoczone są z obu stron przez przez -helisy. W centrum aktywnym białka SpoIIP znajduje się kation cynku koordynowany przez następujące aminokwasy: His189, Glu192, His278 i Glu359. Aminokwasy te są kluczowe dla katalizy i znajdują się w rejonie trzech centralnych -nici: 1, 3 i 6. Są one całkowicie zachowane wśród członków rodziny SpoIIP (rys.1). Centrum aktywne białka wykazuje duże podobieństwo do centrów aktywnych białek wzorców, w których aminokwasami kluczowymi dla katalizy są odpowiednio His10, Glu26, His80, Glu142 dla CwlV oraz His10, Glu23, His79, Glu141 dla PlyPSA. Wejście do centrum aktywnego białka spoIIP jest dobrze dostępne dla substratupeptydoglikanu. Do wygenerowania modelu białka SpoIIP użyłam programu Modeler dostępnego w środowisku InsightII. Struktura białka była wygenerowana w oparciu o struktury wzorców (CwlV oraz PlyPSA). Spośród 5 utworzonych modeli wybrałam model o najniższej energii. W modelu tym przestrzenne położenie aminokwasów kluczowych dla katalizy było najbardziej zbliżone do struktury wzorców. C-terminalna część białka SpoIIP przedstawiona jest na rysunku nr 2. Rys.2. Model trzeciorzędowej struktury C-terminalnej domeny białka SpoIIP wraz z kluczowymi elementami charakteryzującymi fold phosphorylase/hydrolase-like. Przypuszczalny substrat dipeptyd GluAla (część peptydoglikanu) oraz aminokwasy katalityczne pokazane są jako reprezentacja kulek i patyków. Atomy azotu są niebieskie, atomy tlenu są czerwone. Substrat ma kolor zielony. Kation cynku oznaczony jest różową kulką.