Zjawiska/procesy: 1) Potencjał czynnościowy 2) Prądy w kanałach jonowych napięciowozależnych

1. 16.10.2013 Receptory neurotransmiterów, klasyfikacja, drogi wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału

2. Zasadnicze zjawiska i procesy elektryczne w neurobiologii i metody ich badań zjawisk elektrycznych w neurobiologii • Zjawiska/procesy: • 1) Potencjał czynnościowy • 2) Prądy w kanałach jonowych napięciowozależnych • 3) Prądy w kanałach jonowych receptorów jonotropowych • 4) Potencjały i prądy postsynaptyczne na przykładzie płytki końcowej w mięśniach (end-platepotential, end-platecurrent) • 1,4 : Badania za pomocą metody „voltageclamp” • 2,3 : badania za pomocą metody „patch-clamp”

3. Metoda Voltage Clamp Techniki tej używali w latach 50-tych Hodgkin i Huxley (nobel 1963) wyjaśniając dzięki niej mechanizm m.in. potencjału czynnościowego jako zjawiska, które można wytłumaczyć i opisać poprzez zmieniające się w czasie właściwości przewodnictwa błony komórkowej dla poszczególnych jonów

4. Wyniki badań Hodgkina i Huxley’a nad przewodnictwem jonowym w zależności od napięcia błonowego w eksp. Voltage-clamp

5. 3.5 Pharmacological separation of Na+ and K+ currents into components. doświadczenia z lat 60-tych Chlorek czteroetyloamoniowy

6. Potencjał spoczynkowy a stężenie jonów potasu Hodkin i Katz w 1949 r eksperymenty (na aksonie kałamarnicy) ze zmianą stężenia pozakomórkowego K Potencjał równowagi zachowuje się „prawie” zgodnie z równaniem Nernsta Uwaga: stężenie wewnątrzkomórkowe potasu u kałamarnicy ok. 400 mM

7. Dowód, że potencjał spoczynkowy określa głównie gradient stężenia potasu Czarna linia – predykcja potencjału zgodnie z równaniem Nernsta Czerwona linia – rzeczywiste dane pomiarowe potencjału Wykresy najbardziej się różnią dla niższych stężeń potasu (wpływ innych jonów)

8. Błona komórkowa jest znacznie bardziej przepuszczalna dla K niż dla innych jonów Wniosek: potas najbardziej wpływa na zachowanie spoczynkowego potencjału błonowego

9. Rola sodu w gerneracji potencjału czynnościowego Wniosek Hodgkina i Katza : w czasie Pcz następuje gwałtowny wzrost przepuszczalności dla sodu

10. O wartości maks. potencjału czynnościowego decyduje stężenie pozakomórkowe sodu (limituje potencjał równowagi dla sodu) • O wartości potencjału spoczynkowego decyduje stężenie potasu (wniosek: w potencjale spoczynkowym dominuje przewodnictwo potasowe)

11. Metoda Patch Clamp Technika patch-clamp (Erwin Neher, Bert Sakmann 1976 Max Planck Inst. Goettingen ; Nobel 1991) umożliwiła badanie przepływów jonowych (prądów) dla indywidualnych kanałów. Ostatecznie udowodniła istnienie kanałów jonowoselektywnych a jednocześnie potwierdziła wcześniejsze postulaty odnośnie istnienia takich kanałów proponowane przez Hodgkina i Huxley’a

12. Metoda Patch-clamp w badaniu właściwości kanałów jonowychi uzyskane wyniki • Kanały napięciowozależne (voltage-gated)

13. Pomiary prądów jonowych przez pojedyncze kanały Na+ Prądy dośrodkowe • „Makroskopowy” prąd jest sumą mikroskopowych prądów pojedynczych (napięciowozależnych) kanałów

14. Pomiary prądów jonowych przez pojedyncze kanały K+ • „Makroskopowe” prądy potasowe – dozewnątrz (outward) również są zsumowanymi prądami kanałów potasowych • Zarówno kanał potasowy jak i sodowy muszą posiadać „voltage sensor” – strukturę „wyczuwającą” napięcie

15. 4.8 Structure of a simple bacterial K+ channel determined by crystallography. (Part 1) Tetramer zbudowany z 4 podjednostek

16. 4.8 Structure of a simple bacterial K+ channel determined by crystallography. (Part 2) Przechodzą tylko nieuwodnione jony K+ Ujemne ładunki helisy „odwadniają” jony K

17. Eksperymenty z patch-clamp wykazały podobieństwa i różnice pomiędzy różnymi kanałami jonowymi Podobieństwa kanałów K i Na: jonoselektywność, zależność prawdopodobieństwa otwarcia od napięcia, zamykanie kanałów Na i K przez hyperpolaryzację różnice kanałów K i Na: w kinetyce otwarcia (szybkość, czas otwarcia), depolaryzacja w kanale Na prowadzi oprócz otwarcia także do jego inaktywacji(nie w przypadku kanału potasowego UWAGA! Wykryto również napięciowozależne kanały Na które nie są inaktywowane depolaryzacją i prowadzące do długotrwających Pcz – (blokowane przez lidokainę, benzokainę)

18. Patch-clamp w badaniu różnorodności kanałów potasowych

19. Własnościróżnych typów kanałów K+.Eksperymenty na oocytach X.laevis z ekspresją różnych typów kanałów K i pomiarami technika voltage-clamp Kir = Kanały K częściowo napięciowozależne

20. Dwie zasadnicze podgrupy kanałów potasowych: „prostujące” kanały odkomórkowe Rola w hyperpolaryzacji następczej występującej w przebiegu potencjału czynnościowego dokomórkowe kanały prostujące (K-ir) K-ir grają istotną rolę m.in. w kontroli i regulacji potencjału spoczynkowego oraz wartości potencjału progowego.

21. Potasowe „dowewnątrz prostujące” kanały jonowe (K-ir) Cechy: osłabione przewodnictwo w warunkach depolaryzacji podwyższone w warunkach hyperpolaryzacji zdolność do wytwarzania większego dokomórkowego napływu jonów niż wypływu. Blokowanie kierunku „od” (wypływu jonów potasowych) w warunkach depolaryzacji jest skutkiem działania wewnątrzkomórkowego magnezu (Mg2+) oraz polyamin (spermina, putrescyna, spermidyna).

22. Metoda Patch-clamp w badaniu właściwości kanałów jonowych • Kanały zależne od ligandu (np. neurotransmitera)

23. A) Eksperyment typu „outside-out” – pipeta zawiera roztwór o składzie podobnym do cytoplazmy. Na zewnątrz błony z kanałem roztwór jest podobny do zewnątrzkomórkowego. Technika „patch-clamp” Mierzone jest natężenie prądu. Natomiast woltaż jest stabilizowany na dowolnie wybranej wartości

24. Technika „patch-clamp” w badaniu prądu jonowego kanału receptorowego B) Przepływ prądu płynącego przez pojedynczy kanał jonowy po podaniu acetylocholiny (Ach) w sposób ciągły.Obserwacja:1) Prąd płynie w postaci impulsów z zasadą „wszystko-albo-nic”.2) Zwiększenie stężenia Ach nie powoduje zmiany natężenia prądu lecz wzrost prawdopodobieństwa otwarcia kanałuEfekt postsynaptyczny jest wynikiem sumowania potencjałów z wielu kanałów jonowych. Czas otwarcia jest różny ale „amplituda” (natężenie prądu) zawsze ta sama.

25. Technika patch-clamp z kanałem receptorowym: podawanie N-T przy zmienianych wartościach potencjału stabilizowanego napięcia

26. Technika patch-clamp kanałem receptorowym: 1) Po związaniu z NT częstotliwość i średni czas otwarcia kanału są niezależne od napięcia 2) Kierunek i amplituda prądu zależy od napięcia. 3) Kierunek prądu „dąży” do osiągnięcia równowagi zgodnie z równaniem Goldmana-Hodgkina-Katza. 4) Testowany kanał jest tak samo przepuszczalny dla K+ i Na+ (ale różne kanały odpowiedzialne za wytwarzanie EPSP są różnie przepuszczalne dla K+ i dla Na+.) Isc = sc (Vm – Er) „reversal (null) potential” receptora, w tym przyp.= 0 (Są one różne dla różnych receptorów) Prąd płynie na zewnątrz

27. Metoda Voltage-clampBadanie prądów postsynaptycznych ma przykładzie złącza n-mięśń. w zależności od napięcia błonowego () Badania te (wraz z manipulacją stężeń jonów) pomogły ustalić przepływ jakich jonów tworzy te prądy (małżeństwo Akira i Noriko Takeuchi 1960)

28. (EPP) w złączu nerwowo-mięśniowym w warunkach niskiego poziomu Ca2+. Badanie złącza nerwowo-mięśniowego (ryc B) wystarczająco wysoki EPP powoduje powstanie Pcz w mięśniu (ryc C) spontaniczne „mini EPP” (ryc D) przy niskim poziomie Ca++ stymulacja nerwu ruchowego powoduje EPP podobne do „mini EPP”

29. Terminy • EPP – end plate potential – potencjał płytki końcowej w mięśniu – pojęciowo równoważny: EPSP (excitatory postsynaptic potential); • EPC – end plate current – prąd płytki końcowej w mięśniu, pojęciowo równoważny EPSC excitatory postsynaptic current – pobudzający prąd postsynaptyczny:

30. 5.16 The influence of the postsynaptic membrane potential on end plate currents. Kierunek i wielkość prądu EPC zależą od zastosowanego postsynaptycznego napięcia błonowego Potencjał „bez prądu” to tzw. „reverse potential” (potencjał odwrócenia) dośrodkowy outward)

31. W warunkach typowego poziomu wapnia: • Złącze nerwowo-mięśniowe: • Pojedynczy potencjał czynnościowy uwalnia do 300 „kwantów” N-T • Otwarcie pojedynczego pęcherzyka daje pojedynczy „MINI” = rzędu kilku mV • Synapsa glutamatergiczna: • 1 potencjał czynnościowy uwalnia 5-10 kwantów N-T, • Każdy z nich powoduje EPSP=1mV (zdecydowanie za mało do wywołania potencjału czynnościowego)

32. EPC jest proporcjonalny do różnicy między danym napięciem (Vm) i potencjałem odwrócenia (Erev) i do przewodnictwa błony aktywowanej acetylocholiną (gACh) • EPC = gACh (Vm – Erev)

33. Prądy EPC przy zmianie stężeń jonów pozakomórkowych (Na) i (↑K) • Badania Takeushi Naout ↑Kout

34. Co by było gdyby • Kanał jonowy w płytce końcowej był przepuszczalny tylko dla K? tylko dla Na?

35. 5.17 The effect of ion channel selectivity on the reversal potential.

36. 5.17 The effect of ion channel selectivity on the reversal potential. Wartość potencjału „spoczynkowego” z równania GHK przy założeniu, że przepuszczalność dla sodu i potasu jest podobna do Erev (czyli ok. 0 mV) wniosek ?

37. Wpływ potencjału błonowego w błonie postsynaptycznej na prądy płytki końcowej (end-plate currents – EPC) Obniżenie zewnątrzkomórkowego Na (ryc. D) powoduje przesunięcie „reversal potential” w stronę wartości ujemnych Podwyższenie zewnątrzkomórkowego stężenia jonów K (ryc. E) powoduje przesunięcie „reversal potential” w stronę wartości dodatnich Naout ↑Kout

38. Na+ and K+ movements during EPCs and EPPs. (Part 1) Dla typowego potencjału spoczynkowego mieśnia (-90 mV) w EPC dominuje prąd dośrodkowy jonów Na (efekt netto prądów Na i K jest też dośrodkowy)

39. Na+ and K+ movements during EPCs and EPPs. (Part 2) Dla potencjału odwrócenia = 0mV oba prądy jonowe Na i K równoważą się (i znoszą wzajemnie) - „makroskopowy” EPC = 0. Dla potencjału +70mV (równowaga dla Na) istnieje tylko prąd potasowy (dozewnątrz) (hyperpoplaryzuje komórkę postsynaptyczną)

40. Prąd płytki końcowej -EPC i amplituda potencjału płytki końcowej -EPP w zależności od potencjału postsynaptycznego Szczytowa amplituda EPP w zależności od potencjału postsynaptycznego Erev Erev • Prądy dla potencjału powyżej „potencjału odwrócenia” hyperpolaryzują komórkę postsynaptyczną a dla potencjału poniżej „potencjału odwrócenia” depolaryzują komórkę. • Glutaminian zwykle również powoduje otwarcie kanałów przepuszczalnych zarówno dla Na jak i K dlatego ogólny opis zależności jest podobny jak w złączu nerwowo-mięśniowym

41. Istotne terminy • Potencjał odwrócenia (tu dotyczy receptorowych kanałów jonowych): wartość potencjału powyżej którego kierunek prądu w kanale jonowym jest odwrotny niż dla potencjału poniżej; jeśli receptorowy kanał jonowy znajduje się dokładnie w warunkach tego potencjału (wynosi zwykle ok, 0 mV) ruch jonów netto jest zerowy (nie ma prądu) • Potencjał równowagi: dotyczy określonego jonu i oznacza wartość potencjału która równoważy gradient stężenia jonu między przeciwnymi stronami błony komórkowej; wyznaczany równaniem Nernsta • Potencjał spoczynkowy: potencjał błonowy osiągany i utrzymywany relatywnie stabilnie przez komórki w wyniku jako wypadkowa gradientów stężeń jonów i i różnych przepuszczalności dla różnych jonów; obliczany wg równania Goldmana-Hodgkina-Katza • Potencjał progowy: wartość potencjału przy której komórki nazywane komórkami „pobudliwymi” (neurony, mięśnie) wytwarzają tzw. Potencjał czynnościowy • Potencjał czynnościowy: gwałtowna sekwencja zmian potencjału błonowego wg. charakterystycznego i powtarzalnego wzorca charakteryzująca tzw. komórki pobudliwe (neurony, kom. mięsniowe, niektóre endokrynne, a nawet roslinne) i wywołana szybkimi zmianami przewodnictwa dla określonych jonów ( w szczególności sodu i potasu).

42. Potencjał postsynaptyczny (PSP) – bezpośredni efekt działania neurotransmitera • PSP – zmiana wartości potencjału błonowego w błonie postsynaptycznej synapsy chemicznej (w tym złącza nerwowo-mięśniowego) w efekcie działania neurotransmitera. (W wyniku działania neurotransmitera następują zmiany przewodnictwa elektrycznego i powstaje „prąd postsynaptyczny” (postsynaptic current – PSC) w wyniku którego ostatecznie dochodzi do zmiany potencjału postsynaptycznego • PSP - może być pobudzający (excitatory postsynaptic potential – EPSP) lub hamujący (inhibitory postsynaptic potential – IPSP). • PSP podlega sumowaniu czasowemu i przestrzennemu

43. Wartość potencjału odwrócenia zależy od charakterystyki kanału (przepuszczalności dla poszczególnych jonów) oraz od stężeń jonów na zewnątrz i wewnątrz kanału (zgodnie z równaniem GHK) Rezultaty otwarcia receptorowego kanału jonowego zależą od różnicy między potencjałem spoczynkowym (całej komórki nerwowej) a wartością potencjału odwrócenia danego kanału receptorowego. Prąd kanału po jego otwarciu (związaniu z neurotransmiterem) „stara się” zmienić potencjał spoczynkowy w kierunku potencjału odwrócenia dla danego kanału.

44. Prąd jonowy w receptorowym kanale zależny jest od przewodnictwa kanału oraz różnicy potencjału spoczynkowego i potencjału odwrócenia dla kanału ale Skutki jego otwarcia zależą od innych kanałów („przeciekowych” oraz napieciowo-zależnych kanałów jonowych, które znacznie przeważają nad kanałami receptorowymi) Dlatego prąd kanału receptorowego nigdy nie pozwala na znaczne zbliżenie potencjału spoczynkowego do potencjału odwrócenia receptorowego kanału jonowego

45. Postsynaptyczny potencjał pobudzający i hamujący (EPSP) (IPSP) Relacja potencjału progowego i potencjału odwrócenia EPSP (pobudzający) – jego potencjał odwrócenia (Erev) jest bardziej dodatni niż próg pobudliwości

46. Reversal and threshold potentials determine postsynaptic excitation and inhibition. Różnica między EPSP i IPSP IPSP (hamujący) charakteryzuje się tym, że jego potencjał odwrócenia jest bardziej ujemny niż potencjał progowy. EPSP jest depolaryzujący a IPSP zwykle hyperpolaryzujący ale nie musi (w pewnych warunkach IPSP może być depolaryzujący! Wystarczy aby jego Erev był poniżej progu pobudzenia czyli powstania potencjału czynnościowego)

47. EPSP jest depolaryzujący a IPSP zwykle hyperpolaryzujący ale nie musi (w pewnych warunkach IPSP może być depolaryzujący! ) Wystarczy aby jego Erev był poniżej progu pobudzenia

48. Hamowanie (inhibicja) neuronów 1. Poprzez IPSP (z reguły poprzez hyperpolaryzację) 2. Poprzez „przeciek” (shunting inhibition) Otwarcie kanału jonowego dla Cl- w sytuacji gdy w jego „rejonie” potencjał spoczynkowy jest równy potencjałowi równowagi dla chloru (i nie ma prądu jonowego i nie ma hyperpolaryzacji) Skutek: Obniżenie oporu błonowego i umozliwienie neutralizacji dodatnich jonów w rejonie otwartego jonu chlorowego. Ponadto obniżony opór powoduje mniejsze zmiany potencjału (słabszą depolaryzację) pod wpływem działania pobudzającego NT np. glutaminianu (zgodnie z zależnością fizyczną V=IR)

49. Receptory neurotransmiterów JONOTROPOWE - po związaniu z ligandem otwierają kanały jonowe, - - duże rozmiary, zbudowane z podjednostek pobudzenie wywołuje szybko potencjał postsynaptyczny (PSP), który jest jednak krótkotrwały („fast-PSP”- typowo ok. 20ms) METABOTROPOWE (G-protein coupled receptors GPCRs) działają poprzez aktywację białek wiążących GTP utworzone przez pojedynczy polipeptyd. pobudzenie wywołuje długo trwający postsynaptyczny potencjał („slow-PSP”) w zależności od różnych typów białek G i aktywowania różnych wtórnych przekaźników i wewnątrzkomórkowych szlaków tramsdukcji sygnału wpływają nie tylko na zmiany funkcjonowania kanałów jonowych ale na procesy metaboliczne a nawet molekularno-genetyczne (np. ekspresja genów) Mogą bezpośrednio (przez aktywację białka G bez potrzeby indukcji wtórnych przekaźników) modulować aktywność kanałów jonowych

50. Receptory jono i metabotropowe