Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata

1. Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata Laureando: Fabrizio Pittorino Relatore: Tullio Scopigno

2. La mioglobina • Scopo della dissertazione: studiare la cinetica ultraveloce della mioglobina in seguito alla fotodissociazione del ligando. • Funzione fisiologica della mioglobina: legare reversibilmente l’ossigeno. • E’ un’emoproteina: il sito attivo è l’eme: Fe coordinato con i 4 atomi di azoto di una porfirina. • Il Fe può essere 6-coordinato (mioglobina legata) o 5-coordinato (mioglobina non legata). • Stati eccitati transienti a vita ultrabreve (fs, ps) • Fotolisi (impulso elettromagnetico) t < 50 fs • CO • Ricombinazione geminata (reazione in soluzione acquosa) sulla scala del ns Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata 4/11/2011

3. Schema pump e probe • Gli impulsi di pump e di probe sono focalizzati sul campione. • Impulso di pump: ultracorto, utile alla fotolisi. • Impulso di probe: utile allo studio dello spettro di assorbimento transiente del sistema. • Quantità di interesse: differenza di assorbanza del probe in presenza e in assenza del pump: • Variando la lunghezza d’onda del probe e il suo ritardo temporale rispetto all’impulso di pump si ottiene lo spettro di assorbimento transiente del sistema, in cui è funzione del tempo e della lunghezza d’onda. PROBE PUMP Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata 4/11/2011

4. Apparato sperimentale • Laser a Ti:Sa centrato a 800 nm e con frequenza di 30 fs. • Impulso di pump ottenuto tramite OPA a 540 nm per massimizzare la fotolisi • Impulso di probe tramite dispersione non lineare in cristallo di CaF2 • Delay line permette di regolare il ritardo tra pump e probe. • Chopper tarato a 500 Hz permette l’arrivo a intermittenza del pump sul campione. • Monocromatore e CCD raccolgono lo spettro di assorbimento transiente tra 400 e 700 nm • Campione di mioglobina nelle forme legata e non legata. Come si presentano i dati: Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata 4/11/2011

5. Le ipotesi: parallela e sequenziale • Fotolisi: meno di 50 fs. • Ipotesi per la cinetica dell’eme in seguito alla fotolisi del CO in termini dell’apparizione di stati eccitati dell’eme non legato: Mb1 e Mb2. Mb1 Mb1 Mb2 Mb2 Mb Mb MbCO MbCO • Mb1 decade con = 300 fs allo • stato fondamentale della proteina non legata. • Mb2 si rilega con il CO con = 3 ps. • Ricombinazione geminata tra Mb e CO • sulla scala del nanosecondo. • Canale di formazione di Mb2 inibito nella MbCO. • Mb1 è creato istantaneamente, decade • contemporaneamente nello stato fondamentale e in Mb2. • Mb2 non è creato istantaneamente! • k10, k12 e k20 frequenze di transizione Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata 4/11/2011

6. Modello per l’ipotesi sequenziale • Proponiamo un modello per l’ipotesi sequenziale: • Condizioni iniziali • Autovalori: • Soluzione • Autovettori: Nonostante tre frequenze di transizione, solo due tempi caratteristici del sistema! Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata 4/11/2011

7. Analisi dati: Presentazione • Spettro di assorbimento transiente della mioglobina non legata: in funzione di e t. • Chirp temporale: dovuto alla variazione dell’indice di rifrazione con (…e visibile data l’elevata risoluzione temporale)! • Possibile eliminazione del chirp tramite routine scritta su MatLab. Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata 4/11/2011

8. Analisi dati: Presentazione • Risultato dell’eliminazione del chirp nello spettro della mioglobina non legata. • Picchi: “nascita” di: • Mb1 (462 nm) • Mb2 (448 nm) • Scomparsa dello stato fondamentale (435 nm). • Analogamente per la proteina legata con il CO: • Assenza di picco a 448 nm (Inibizione di formazione Mb2) • Baseline rappresenta la lenta ricombinazione geminata. Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata 4/11/2011

9. Analisi dati: a singola lunghezza d’onda (Mb) • Un primo approccio può essere eseguire fit a singola lunghezza d’onda sui picchi di assorbimento delle specie transienti (problema delle code). • In accordo col nostro modello, fit bi-esponenziali. • Mb: 435 nm • Mb2: 448 nm • Mb1: 462 nm Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata 4/11/2011

10. Analisi dati: a singola lunghezza d’onda (MbCO) • Analoghi risultati per la mioglobina legata con il monossido di carbonio. • Per rappresentare la ricombinazione geminata bisogna inserire una baseline. • Mb: 435 nm • Mb2: 448 nm • Mb1: 462 nm Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata 4/11/2011

11. Analisi globale: SVD • La sovrapposizione degli spettri di assorbimento delle specie transienti rende difficoltosa l’estrazione dell’informazione lontano dai picchi di assorbimento. • Una possibile soluzione è effettuare un’analisi simultanea su tutte le lunghezze d’onda. • L’analisi globale è condotta usando il pacchetto MatLab Ultrafast Toolbox. • Primo passo: SVD. Questo tipo di analisi permette la stima del numero di processi attivi del sistema decomponendo la matrice dei dati in spettri di base pesati. Quelli con peso maggiore rappresentano il segnale, gli altri sono rumore. • Risultati per la mioglobina non legata: • Si confermano due processi dominanti… e un terzo non trascurabile. Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata 4/11/2011

12. Analisi globale: Global Fit • Global fit: fit simultaneo su tutte le lunghezze d’onda, che ha come parametri i tempi caratteristici corrispondenti ai processi attivi del sistema e a ognuno di essi associa uno spettro indipendente dal tempo. • I dati possono essere ricostruiti secondo la formula: • Dati caricati: • Un processo in più. • … I tempi caratteristici sono sovrastimati! • Questo è imputabile alla presenza del cooling vibrazionale (il terzo processo). Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata 4/11/2011

13. Cooling vibrazionale • La foto-eccitazione all’origine delle specie elettroniche ha come risultato specie vibrazionalmente calde. I picchi di assorbimento di queste si spostano quindi nel tempo, “raffreddandosi”. • Fit con combinazione lineare di gaussiane permette di estrarre la posizione dei picchi • Spostamento dei picchi nel caso della mioglobina non legata. • Spostamento del picco nel caso della mioglobina legata. • Possibile distorsione dovuta a Mb2 • Tempi caratteristici paragonabili a quelli della foto-cinetica Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata 4/11/2011

14. Conclusioni • Ci siamo occupati di studiare nel dettaglio la cinetica ultraveloce della mioglobina in seguito alla fotolisi del ligando CO. • Il nostro studio, effettuato sia tramite fit a singola lunghezza d’onda • sia con fit simultanei su tutto lo spettro di assorbimento transiente, • conferma l’apparizione di due stati eccitati in seguito alla fotolisi • e il loro decadimento sequenziale verso lo stato fondamentale. • Il cooling vibrazionale è un’ulteriore complicazione all’interpretazione dei dati • e ne abbiamo studiato le dinamiche, evidenziando di lavorare con stati dell’eme vibrazionalmente caldi, sia per lo stato fondamentale sia per gli stati eccitati. Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata 4/11/2011

15. Analisi dati: Presentazione • Traccia temporale a 435 nm nel caso della proteina non legata: • Assorbimento transiente in funzione della lunghezza d’onda a tempi selezionati. Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata 27/10/2011

16. SVD e global fit • La sovrapposizione degli spettri di assorbimento delle specie transienti rende difficoltosa l’estrazione dell’informazione lontano dai picchi di assorbimento. • Singular value decomposition: decompone i dati vvvvv nel modo seguente: • dove S è una matrice diagonale mxn che contiene le singular values, U le tracce nel dominio del • tempo e V quelle nel dominio spettrale. • Decomposizione di una matrice in somma pesata di matrici di base. • Matrici separabili, possono essere scritte come prodotto esterno di due vettori: • o in coordinate: • Si ottiene così: dove le rappresentano le singular values. • Base di componenti ortogonali che può riprodurre i dati tramite combinazione lineare (non hanno necessariamente un significato fisico). • Le componenti della base corrispondenti alle SV più alte rappresentano il segnale, le altre il rumore. • Permette di estrarre il numero dei processi attivi presenti nei dati.

17. SVD e global fit • La sovrapposizione degli spettri di assorbimento delle specie transienti rende difficoltosa l’estrazione dell’informazione lontano dai picchi di assorbimento. • Global fit permette di estrarre costanti di tempo e spettri indipendenti del tempo corrispondenti ai processi attivi presenti nei dati. • Pacchetto Ultrafast Toolbox: algoritmo patternsearchper la ricerca del minimo assoluto della • somma dei residui dove è la matrice dei dati aspettata. • Il problema è multidimensionale (su tutte le lunghezze d’onda) • minimizzazione su una ipersuperficie. • Nella spettroscopia ultraveloce i dati di assorbimento transiente sono descritti da: • dove le sono gli spettri funzione di e • indipendenti dal tempo. I sono le costanti di tempo corrispondenti e sono i parametri di fit. • Lo scopo è dunque trovare questi due parametri. • Tramite SimBiology si può caricare il modello tramite il quale si effettuerà il global fit sui dati (prima profili di concentrazione, poi fit sui dati).