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Ministério da Saúde Fundação Oswaldo Cruz - Fiocruz Depto. de Imunologia - IOC

Ministério da Saúde Fundação Oswaldo Cruz - Fiocruz Depto. de Imunologia - IOC Lab. de AIDS e Imunologia Molecular. Seminário Brasil França 2006 Diversidade Genética e Genotipagem do HIV-1 aos Anti-Retrovirais José Carlos Couto-Fernandez Fortaleza,CE NOVEMBRO 2006. Histórico

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  1. Ministério da Saúde Fundação Oswaldo Cruz - Fiocruz Depto. de Imunologia - IOC Lab. de AIDS e Imunologia Molecular Seminário Brasil França 2006 Diversidade Genética e Genotipagem do HIV-1 aos Anti-Retrovirais José Carlos Couto-Fernandez Fortaleza,CE NOVEMBRO 2006

  2. Histórico • 1981 - Descrição dos primeiros casos de AIDS (Gottlieb 1981, CDC 1982) • 1983 - Isolamento do HIV-1: L. Montagnier, França (Barré-Sinossi 1983) • 1986 - Isolamento do HIV-2: Clavel, França • HIV  Acentuada variabilidade genômica e fenotípica (Alizon 1984, 1986; Wain-Hobson 1985; Asjo 1986) • 1987 - Primeiro isolamento do HIV-1 no Brasil (Galvão-Castro 1987) • HIV  Acentuada variabilidade genômica e fenotípica (Couto-Fernandez 1992, 1994; Potts 1993; WHO 1992,1994) • Estudos sobre diversidade do HIV são de fundamental relevância em relação ao desenvolvimento de vacinas anti-HIV/AIDS e a susceptibilidade aos ARV.

  3. ESTIMATIVA DE ADULTOS/CRIANÇAS VIVENDO COM HIV/AIDS Leste Europeu e Ásia Central 1,6 milhão Oeste Europeu 720 000 América do Norte 1,2 milhão Leste Asiático e Pacífico 870 000 Norte e Centro-Leste da África 510 000 Caribe 300 000 Sul e Sudeste da Ásia 7,4 milhões África Sub-Saariana 25,8 milhões América Latina 1,8 milhão Austrália e Nova Zelândia 74 000 Total: 40,3 milhões Fonte: http://www.unaids.org Dezembro 2005

  4. SUMÁRIO DA EPIDEMIA DE HIV/AIDS NO BRASIL 1980-2005 371.827 Número de casos de HIV/aids Total Homens 251.979 118.520 M ulheres Crianças < 13 anos 10.404 224.463 Categoria de exposição (Adultos) Sexual Sanguínea 60.732 Vertical 10.404 39.894 Ignorada Mortes por aids 1980-2004 Total 172.048 Prevalência: 0,65% * Casos notificados até junho/2005 Fonte: Boletim Epidemiológico do Ministério da Saúde/ PN-DST e Aids-MS, 2005.

  5. Notificações de Casos de Infecção pelo HIV-1 em Municípios Brasileiros (1980-2001) 1994-2001 1987-93 1980-86 Fonte:PN-DST/AIDS-MS, 2003

  6. ESTRUTURA ESQUEMÁTICA DO HIV-1 Família RETROVIRIDAE Subfamília LENTiVIRINAE Gênero LENTIVIRUS Fonte: http://www.vircolab.com

  7. ORGANIZAÇÃO ESQUEMÁTICA DO GENOMA DO HIV-1 Adaptado de: http://www.hivmedicine.com/

  8. Comparison of Genomes: Human and Viruses Comparação dos genomas: humano e víral • Length: 882.5 feet • Weight: 46,329 tons • Length: .4 inches • Weight: < 1 ug HIV-1 has to do many things with a limited genetic repertoire. Therefore, it exploits host factors in order to replicate. O HIV-1 tem muitas coisas para fazer com um repertório genético limitado, por isso ele utiliza fatores do hospedeiro para se replicar.

  9. HIV-1 Life CycleCiclo de Vida do HIV-1 REVERSE TRANSCRIPTION VIRUS MATURATION VIRION BINDING / UNCOATING NUCLEAR ASSOCIATION OF VIRAL cDNA

  10. Protease inhibitors(PI) act to bind directly to the HIV protease and block its activity Os Inibidores de Protease(IP) agem ligando-se diretamente a protease do HIV bloqueando sua atividade

  11. ORIGEM DA DIVERSIDADE DO HIV-1 • Erros de transcrição da transcriptase reversa (TR) viral • TR não possui atividade de reparo de DNA > Transcrição Reversa = Mutação • Genoma (RNA) de ~104nucleotídeos • Taxa de erro da TR = ~2,7 X 10-4mut / nt • Índice de mutação de 1 erro/ 30.000 pb • Elevada taxa de replicação viral (> Vírus gerados por dia = 1010 a 1011) e de ciclos replicativos (> 300 ciclos/ano) • Substituições de nucleotídeos, deleções e inserções • Capacidade de recombinação • Pressao das drogas ARV seleciona virus mutantes Todas as possibilidades de mutações são geradas a cada dia no genoma viral...

  12. CLASSIFICAÇÃO DO HIV • HIV-2 • -Oeste da África • -Homologia de 80% com SIVsooty mangabey • -Homologia entre 40-60% com HIV-1 • - 8 subtipos: A, B e (C, D, E, F, G, H) • HIV-1 • -Pandemia Mundial • -3 grupos: • Grupo M • 9 Subtipos: • A-D, F-H, J e K • - 32 CRF • - Várias URF • Grupo O • Guiné Equatorial, • Camarões e Gabão • Grupo N • Camarões

  13. Árvore filogenética dos diferentes grupos e subtipos de HIV-1

  14. DISTRIBUIÇÃO GLOBAL DOS SUBTIPOS GENÉTICOS (env) DO HIV-1 A B C B B B Other A C C B Other B E A B C A D B A E 3.2% Others 5% (F, G, H, J, NT) B C D 5.3% A27% C47.2% B 12.3% C Adaptado de: Osmanov S, 2005. WHO-UNAIDS HIV Isolation and Characterization

  15. RORAIMA RORAIMA (1) (1) DISTRIBUIÇÃO DOS SUBTIPOS DE HIV-1 NO BRASIL B,F,B/F B,F,B/F B,F,B/F,C B,F,B/F,C,D,A,CRF02_AG C,B,B/C,F,B/F,A

  16. IMPLICAÇÕES DA DIVERSIDADE DO HIV-1 VACINAS SOROLOGIA DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO VIRAL PATOGENICIDADE RESISTÊNCIA aos ANTI-RETROVIRAIS

  17. Subtipos de HIV e Susceptibilidade as Drogas Anti-retrovirais • Isolados de HIV-1 grupo O e HIV-2 são naturalmente resistentes aos ITRNN (Descamps, 1997). • Redução de susceptibilidade in vitro aos ITR (ZDV, 3TC, ddI, NVP) de isolados de HIV-1 subtipo D (Palmer, 1997). • Redução de susceptibilidade in vitro aos IP de isolados do subtipo G (Descamps, 1998). • Redução de susceptibilidade in vitro aos ITRNN em isolados do subtipo F (Apetrei, 1998). • Elevada ocorrência de mutações de resistência em amostras do subtipo C após dose única de nevirapina, em comparação aos subtipos A e D (Eshleman 2005) • Diferentes estudos tem mostrado a existência de polimorfismos (‘minor mutation” e substituições atípicas) entre amostras não-B em posições associadas a resistência na protease e TR (Vergne 2000; Kantor & Katzenstein 2003).

  18. Resposta ARV e Subtipos B/F JAIDS 24,4:399-4000, 2000

  19. Classificação IAS

  20. Resistência in vivo ao Nelfinavir Primeira Falha ao Nelfinavir (Não B = 100%) 57.1% 43.9% D30N L90M Resgate fácil Resistência cruzada

  21. Diversidade Genética do HIV e alteração natural da susceptibilidade a ARVs • Subtipo C e rápida resistência a ITRNN (V106M) • Subtipo F “resistência natural” aos IPs (L89M) • Subtipo C hipersusceptibilidade ao Lopinavir-r (I93L, CH50 = 0,35)

  22. Programa Brasileiro para Terapia anti-HIV/AIDS • Entre os diferentes programas conduzidos pelo Programa Nacional de DST e Aids-MS para pessoas vivendo com HIV/Aids, destaca-se o acesso universal gratuito as diferentes drogas que compoem a terapia anti-retroviral (TARV). • Inicida nos anos 90 através da distribuição do AZT, este programa se consolidou ao longo dos anos. • Em 1996 com a introdução da terapia combinada de alta potência (HAART), a grande maioria de dos indivíduos infectados pelo HIV-1, tem acesso garantido a todas medicações que compoem a TARV. • Estabelecimento das redes de laboratorios para quantificacao de CD4/CD8 e carga viral do HIV-1. • A politica brasileira de acesso universal a terapia anti-HIV tem resultado na queda dos níveis de morbidade e motalidade e uma melhora significativa da qualidade de vida dos indivíduos infectados (Marins e cols., 2003).

  23. O desenvolvimento de resistência às drogas anti-HIV/Aids, além de acarretar a falha em suprimir a replicação viral, pode comprometer o Programa Brasileiro de acesso universal a TARV aos pacientes infectados. • Com isto, o Ministério da Saúde através do Programa Nacional de DST e AIDS estabeleceu em 2002 a Rede Nacional de Genotipagem da Resistência do HIV-1 (RENAGENO). • Objetivo Principal • Instalar uma rede composta de laboratórios e médicos de referência em genotipagem (MRGs), capacitados a realizar a interpretação dos exames de genotipagem para pacientes infectados pelo HIV/Aids através rede pública de saúde,. RELEVÂNCIA

  24. Rede de Laboratórios da RENAGENO Composto de 21 laboratórios nas 5 diferentes regiões do Brasil. Pará (PA): 01 Pernambuco (PE): 01 Bahia (BA): 01 Brasília (DF): 01 Minas Gerais (MG): 01 Rio de Janeiro (RJ): 03 São Paulo (SP): 03 Rio G. do Sul (RS): 01 ES, PR, SC,CE: 01

  25. RENAGENO STRUCTURE Clinical Genotyping Reference Doctor-MRG Collect samples Analysis Laboratory

  26. METODOLOGIA ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System V 2.0 (ABBOTT)  Stage 1,3 mL plasma Extraction / purification of viral RNA Sample Preparation Module HIV Plasmatic RNA RT-PCR Module, Prt/5’ RT cDNA PCR Module Amplified HIV-1 DNA * 1.8Kb Quantification agarose gel DNA Mass Ladder* Purificated DNA fragments

  27. METODOLOGIA 2 Sequencing Module Sequencing Processing Sequences Analysis Sequence Analysis HIV-1 Resistance Report

  28. Prevalence of resistance-associated mutations in the reverse transcriptase gene 80,0% 70,0% 60,0% * * * 50,0% * B * * 40,0% non-B 30,0% 20,0% * * 10,0% 0,0% V75I E44D F77L T69D D67N M41L K65R K70R L100I S68G L74V V118I V108I P225H K101E G333E A62V K103N M230L Q151M Y115F F116Y L210W M184V Y181C/I Ins 69 K219Q/E T215Y/F Y188C/L G190S/A V106M/A NNRTIs NRTIs Fisher’s exact test: *p <0.05. Couto-Fernandez et al., 2005

  29. Prevalence of resistance-associated mutations in the protease gene * * * * * Fisher’s exact test: *p< 0.05 Couto-Fernandez et al., 2005

  30. Prevalência de mutações de resistência aos inibidores nucleosídicos da transcriptase reversa (INTR) Couto-Fernandez et al., 2006

  31. Prevalência de mutações de resistência aos inibidores não-nucleosídicos da transcriptase reversa (INTR) Couto-Fernandez et al., 2006

  32. Prevalência de mutações de resistência aos inibidores da protease (IP) Couto-Fernandez et al., 2006

  33. Geographical distribution of the HIV-1 genetic subtypes in Rio de Janeiro State, Brazil. Couto-Fernandez et al., 2005

  34. Geographical distribution of the human immunodeficiency virus type 1 genetic subtypes in the state of Rio de Janeiro, Brazil Couto-Fernandez et al., 2006

  35. ABSTRACT HIV-1 Subtype D occurs mainly in East and Central African countries, especially Uganda, where the prevalenceof HIV-1 infection is among the highest in the world. We present the phylogenetic analysis of one nonautochthonous and four autochthonous (including a near full-length genome) Brazilian HIV-1 subtype D strains identified in Rio de Janeiro State, where subtypes B, F1, and BF1 recombinants predominate. Phylogenetic inferences using maximum likelihood were applied on a near-full length genome and on concatenated gag, protease, reverse transcriptase, integrase, C2V3/env, gp41, and nef segments. Sequences from an Angolan immigrant showed close genetic similarity with a strain described in Finland, from an HIV patient of African origin, whereas all four autochthonous Brazilian sequences clustered with South African strains, where subtype D occurs only in isolated cases. Our results suggest the successful introduction and circulation in Brazil of closely related HIV-1 subtype D strains, possibly of South African origin.

  36. Resultados 1 FIG. 1. Maximum likelihood phylogenetic analysis places the near-full length 96BRRJ100 genome within the subtype D branch. Alignments were prepared with reference group M sequences gathered from the Los Alamos HIV database.

  37. Resultados 2

  38. Short Communication Accepted to AIDS Research and Human Retroviruses 2006 Molecular Epidemiology of HIV Type 1 in Inner Rio de Janeiro State, Brazil Walter A. Eyer-Silva, José Carlos Couto-Fernandez and Mariza G. Morgado ABSTRACT In the State of Rio de Janeiro, Brazil, HIV-1 diversity surveys have been performed mainly in the capital, and little is known about its molecular epidemiology in inner cities of the State. We studied a total of 87 polymerase sequences recovered from 2 different cohorts in 30 inner cities throughout the Rio de Janeiro State. Subtypes B (83.9%), F1 (8%), D (2.3%), and unique BF1 recombinants (5.7%) were demonstrated. The cross-sectional study found evidence that 41.6% of the patients harbored genetically related clusters of strains and probably took part in the same chain of viral spread. These clusters were phylogenetically unrelated to previously reported clusters from a neighboring city, suggesting that each small city harbors its own set of micro-epidemic lineages.

  39. Prevalence of mutations known to confer reduced susceptibility to antiretroviral agents among 50 treatment-naïve and 45 antiretroviral-experienced HIV-1-infected patients receiving care in small cities of inner Rio de Janeiro State, Brazil, 2004-2006.

  40. Infection, Genetics and Evolution, in press 2006 ABSTRACT The reconstruction of the epidemic history of several HIV populations, by using methods that infer the population history from sampled gene sequence data, has revealed important subtype-specific and regional-specific differences in patterns of epidemic growth. Here, we employ Bayesian coalescent-based methods to compare the population history of the HIV-1 subtype B and F1 epidemics in Brazil from non-contemporary env and pol gene sequences. Our results suggest that after the introduction of the subtypes B and F1 into Brazilian population, around mid to late 1960s and late 1970s, respectively; these subtypes experienced an initial period of exponential growth with similar epidemic growth rates (~0.5-0.6 year-1). Later, the spreading rate of both subtypes seems to have slowed-down since mid to late 1980s. This demographic pattern is very similar to that reported for the subtype B epidemics in high income countries where HIV was initially transmitted through homosexual intercourse and injecting drug use, as in Brazil; suggesting that the characteristics of transmission networks may be a key determinant of the HIV epidemic growth pattern. It is important to note that most of the subtype B and F1 sequences used in this study come from the Southeast region that has been the most affected by the AIDS epidemic in Brazil, being responsible for around 63 % of all AIDS cases reported since the early eighties; but may not represent the demographic trend of the HIV-1 epidemic in otherBrazilian regions.

  41. RESULTS

  42. Fig 1. Bayesian phylogenetic trees of Brazilian C2-C3 env sequences. (a) Subtype F1sequences. Indexes: Brazilian sequences (.), sequences of African origin (.), and Romanian sequences (.). Subtype F2 reference sequences were used to root the tree, and the Most Recent Common Ancestor (MRCA) node of the Brazilian subtype F1 cluster is highlighted. (b) Brazilian subtype B sequences. Indexes: Brazilian “GPG” sequences (.),Brazilian “GWG”, “GCG”, “GLG”, “GRG”, and “GGG” sequences (.), non-Brazilian subtype B sequencesscale is in calendar years.

  43. Fig 2. Bayesian skyline plots representing nonparametric estimates of effective number of infections through time for HIV-1 subtypes B (a) and F1 (b) epidemics in Brazil,

  44. Prevalência de mutações de resistência aos inibidores da transcriptase reversa

  45. Prevalência de mutações de resistência aos inibidores da protease

  46. CONCLUSIONS • According to our findings, subtype F1 appears to have been introduced into Brazil between 10 and 15 years later (late 1970s) than the subtype B (mid to late 1960s), consistent with our previous report (Bello et al, 2006). • This clearly suggests that subtype B HIV-1 epidemics in US, Western Europe, and Brazil started around the same time, which is fully consistent with the concurrent detection of the first Aids cases in those regions during early 1980s. • These analyses also suggest that the Br-B variant emerged since the beginning of subtype B epidemic in Brazil, which explains the high prevalence of this variant in the country. • The high growth rates described for the Brazilian subtypes B and F1 epidemics in the present work are consistent with such hypothesis, since in Brazil a significant proportion of the HIV-1 infections (~60%) can be attributed to homo/bisexuals and injecting drug users networks, in particular during the first years of the epidemic (1980-1993) (Brazilian Ministry of Health., December 2005). • No significant correlation was observed in the drug resistance evolution between subtype B and F strains.

  47. Submited to AIDS Research and Human Retroviruses 2006 SEARCHING FOR A CRF_B/F IN HIV-1 RECOMBINANT B/F VIRUSES FROM RIO DE JANEIRO, BRAZIL M Guimarães, Couto-Fernandez JC, Walter Eyer-Silva,C Siva-de-Jesus, S Teixeira, S Chequer-Fernandez, ,M Morgado Lab. de AIDS & Imunol. Mol., Dep. de Imunologia, IOC; Rio de Janeiro, RJ, 21045-900, Fundação Oswaldo Cruz Background: Brazil has been referred to be the one of “geographic recombination hotspots”, with a high frequency of mosaic viruses and up to now, at least three CRFs(12,28,29) and several URFs evolving subtypes B and F have been described. The present study is to search for common genetic recombinant profile among BF HIV-1 samples from Rio de Janeiro and compare them with those CRF B/F. Results: From these 1500 samples already analyzed just 47 could be characterized as BF in the pol gene, most of them presenting different patterns of recombination, but we were also able to identify 4 distinct well defined phylogenetic clusters, composed at least by 3 samples that share the same pattern of recombination. Conclusions: None of thefour distinct B/F recombinant genetic profiles analyzed, gathered with high bootstrap value with CRF12,28 or 29, although some of them present some equal breakpoint.

  48. Phylogenetic analyzes of BF recombinant forms REN207.03 & REN214.03 REN046.02 & REN287.04 REN025.04 100 REN137.04 REN010.02 59 REN049.04 & REN269.04 CRF_12 81 Subtype B REN178.04 REN232.03 100 88 77 REN034.02 & BREPM108 REN090.02 & 99UFRJ2BF 100 REN123.02 & REN210.04 91 83 Subsubtype F1 REN217.03 REN213.03 BF1 recombinants (this study) Other Brazilian BF1 strains Subsubtype F1 Subtype B CRF_12 0.1

  49. Phylogenetic analyzes of BF recombinant forms GROUP 5 B B F GROUP 2 F B CRF_28 CRF_29 CRF_12 SUBTYPE B B F B B F GROUP 4 GROUP 6 GROUP 7 B F GROUP1 Sub-Subtype F1 B F B F GROUP 3 Samples were analyzed using the SplitsTree Decomposition methodology. Subtype B and F as well as CRF 12, 28 and 29 references were use d in this evaluation. Bootscanning representation of samples characterized as recombinant in the different regions were represented here. Analysis of pol- PR/RT (1280bp)

  50. CONCLUSÕES FINAIS 1 • Uma grande proporção do subtipo B do HIV-1 foi observada em pacientes do Estado Rio de Janeiro, apresentando falha a terapia anti-antiretroviral. • A baixa prevalência do subtipo F neste grupo, quando comparada a estudos prévios baseados no envelope viral, pode ser devido a elevada frequência de vírus recombinantes entre amostras do subtipo F. • Observamos a circulação dos subtipos C e D do HIV-1, URFs CF e AF, além da primeira descrição no Brasil da presença das CRF02_AG e CFR01_AE no Estado do Rio de Janeiro. • A distribuição das diferentes mutações de resistência no grupo de estudo mostrou correlação com a TAR utilizada.

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