Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central

1. Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central Lahouari AMAR LGN - UMR 7091 sous la direction du Docteur Jacques MALLET

2. Le transfert de gène dans le SNC • Les vecteurs lentiviraux - caractéristiques - avantages et méthode de production - applications • Résultats Développement d’un seul vecteur lentiviral pour: 1) l’expression régulée d’un facteur protéique 2) l’expression régulée de shARN • Conclusion générale et perspectives

3. Transfert de gène dans le SNC In vivo Gène thérapeutique: protéine ou séquence nucléotidique (siARN) Ex vivo Cellules transduites

4. Spécificités du système nerveux central relatives au transfert de gène • Présence de la barrière hématoencéphalique • Limite le passage de molécules thérapeutiques • Nécessité du transfert de gène… • La majorité des cellules du SN sont quiescentes • Possibilité d’utilisation de vecteurs intégratifs ou épisomaux • Vecteurs non viraux peu efficaces à long terme • préférentiellement viral… • Diversité cellulaire • Nécessité d’expression restreinte ou élargie du facteur thérapeutique • Possibilité  de ciblage d’une structure ou noyau particulier dans le SN • Transport rétrograde ou antérograde dans les neurones • avec un vecteur dont le tropisme est modulable. Vecteurs lentiviraux particulièrement adaptés

5. Avantages des vecteurs lentiviraux • Transduction des cellules quiescentes et en division • Expression stable et à long terme du transgène dans le SNC • Faible toxicité • Facilité de production à haut titre dénuée de RCR • Pseudotypage aisé

6. tat Plasmide transcomplémentant gag PhCMV pA Pro pol Ψ rev VSV-G pA PhCMV Plasmide d’enveloppe PPT Pro Plasmide vecteur 5’LTR RRE cPPT Transgène WPRE 3’LTR Ψ U3 VSV-G Vecteurs lentiviraux : méthode de production Particules virales pseudotypées avec la protéine G du virus de la stomatite vésiculaire (VSV-G)

7. Applications des vecteurs lentiviraux • Thérapie génique • Production d’animaux transgéniques (modèles de maladies…) • Etude de fonction de gènes (surexpression ou inhibition par siARN)

8. Nécessité d’un système régulable • Etudes cliniques • Moduler l’expression du facteur thérapeutique • Arrêt du traitement en cas de complication grave • Etudes fondamentales • Contrôle temporel du transgène • Contrôle du niveau d’expression

9. VP16 rtTA PGK rTetR rTetR VP16 + Tet Tet Tet VP16 Tet rTetR CMVmin CMVmin 7TetO Transgène Transgène 7TetO Le système de régulation inductible par la Tetracycline (Tet-on)

10. 1. Développement d’un seul vecteur lentiviral pour l’expression régulée d’une protéine thérapeutique

11. Nécessité d’un vecteur unique • Réduction de la quantité de vecteur administrée: • Réduction du risque de mutagenèse insertionnelle • Réduction du risque d’immunogénicité lié au vecteur • Permettre l’expression du transgène et du transactivateur dans la même cellule

12. PPT rtTA2-M2 PPGK BGH polyA Pcmv min 5’LTR Ins Stuffer cPPT Transgène WPRE 3’LTR Ψ U3 Un vecteur lentiviral unique pour l’expression régulée d’un transgène • Luciférase • - Tyrosine hydroxylase

13. Expression régulée de la luciférase in vitro Transduction d’une culture primaire d’astrocytes + Dox - Dox

14. Effet de la doxycycline sur l’activité luciférase Cinétique d’induction in vitro Réversibilité in vitro Dose optimale in vitro

15. Injection du vecteur lentiviral exprimant de façon régulée la luciférase dans le striatum de rat + Dox - Dox

16. Un vecteur lentiviral exprimant de façon régulée la tyrosine hydroxylase Evaluation in vitro + Dox - Dox

17. Un vecteur lentiviral exprimant de façon régulée la tyrosine hydroxylase Evaluation in vivo Contrôle non injecté + Dox - Dox

18. Résumé • Construction d’un seul vecteur lentiviral portant un système de régulation Tet-on • Validation in vitro et in vivo • Niveau d’induction fort • Fuite non détectable en absence d’inducteur • Dose d’inducteur élevée in vivo

19. Applications, limites et voies d’amélioration • Application de ce vecteur Tet-on • Utilisation in vitro • Utilisation chez l’animal • Exemple : stratégie de neuroprotection • Limites dans une stratégie de remplacement? • Utilisation en clinique exclue • Nombre faible de cellules exprimant le transgène in vivo après induction • Quantité de vecteur utilisée sous optimale • Défaut de retrotranscription d’un génome vecteur long • Co-expression du transactivateur et du transgène Un vecteur versus deux vecteurs?

20. 2. Développement d’un seul vecteur lentiviral permettant l’expression régulée de shARN

21. L’ARN interférence

22. Expression des siARN

23. STAF1 Oct1 Pol III +1 TBP -244 -149 -66 -24 SNAPc -47 -29 Un promoteur d’ARN Polymérase IIILe promoteur U6 • L’expression des shARN nécessite l’utilisation d’un promoteur d’ARN polymérase III • Débute la transcription à un nucléotide défini (G) • Arrêt de la transcription par 5 thymidines Site de démarrage de la transcription ESD ESP TATA shARN TTTTT G core

24. shARN ESD ESP TATA Pol III Pol III Avec inducteur : synthèse des siARN TBP SNAPc shARN ESD ESP TATA inducteur Stratégie négative : encombrement stérique inductible d’un promoteur polymérase III Sans inducteur : inhibition de la synthèse des siARN Protéine SNAPc TBP

25. Pol III Pol III TBP SNAPc shARN ESD ESP TetO TATA Encombrement stérique inductible du promoteur U6 par le système tétracycline Sans Doxycycline : inhibition de la synthèse des siARN shARN ESD ESP Tet0 TATA répresseur Tet TBP SNAPc Avec Doxycycline : synthèse des siARN doxycycline

26. +1 -47 -66 -29 -244 -149 -24 ESP ESD TATA ESD ESP TATA TetO TATA ESD ESP TetO ESD ESP TATA TetO TetO ESD TetO ESP TATA TetO TetO ESD TetO TetO ESP TATA TetO TetO ESD TetO TetO TetO ESP TATA TetO TetO Un promoteur U6 régulable :Stratégie négative

27. % de cellules GFP positives Inhibition de l ’expression de la GFP dans des cellules HEK 293T-GFP

28. Stratégie positive : adaptation du système Tet-on à un promoteur d’ARN polymérase III • Utilisation d’un transactivateur de l’ARN polymerase III • Utilisation d’un promoteur polymérase III minimal inductible par la tétracycline

29. Q18III(QA) VP16 Q18III(QA) Q18III(QA) Q18III(QA) Domaine transactivateur VP16 du virus HSV Domaine transactivateur Développement d’un transactivateur de promoteur polymérase III inductible par la doxycycline Un nouveau transactivateur rtTA-Oct2 rtTA Domaine de liaison à l’ADN du rtTA2-M2

30. 7 TetO Développement d’un promoteur U6 minimal inductible par la doxycycline Un nouveau promoteur DSE ESP Boîte TATA

31. Oct-2 rtTA Pol III ESP Boîte TATA sens antisens TTTTT boucle 19 pb 19 pb 9 pb 7 TetO 5’ sens shARN UU antisens Un promoteur d’ARN Polymérase III inductible par la doxycycline Dox TBP +1 SNAPc

32. PPT PPGK PU6 min shGFP 5’LTR cPPT rtTA-Oct2 WPRE 3’LTR Ψ U3 Un vecteur lentiviral pour l’expression régulée de shARN dirigé contre la GFP Pas d’expression de shGFP Synthèse de la GFP - dox Expression de shGFP Inhibition de la GFP + dox

33. + Dox - Dox Une expression de shGFP régulée Northern Blot Transduction de cellules HEK293T-GFP avec différentes quantités de vecteur lentiviral exprimant de façon régulée un shGFP

34. - Dox + Dox Expression de shGFP en fonction de la concentration de doxycycline

35. Cinétique d’expression du shARN - Dox + Dox + Dox - Dox

36. Application du système pour la régulation d’un gène endogène : p53 HEK293T MCF-7 A549

37. Résumé • Construction d’un système de régulation qui permet une expression contrôlée par la doxycycline de shARN • Validation du contrôle d’un gène endogène • Forte inductibilité • Système réversible • Forte concentration de doxycycline

38. Limites et perspectives • Dose de doxycycline • Validation in vivo Expression de shARN par promoteur pol III versus promoteur pol II

39. Conclusion générale • Construction d’un seul vecteur lentiviral pour l’expression régulée par le système Tet-on d’une protéine thérapeutique. • Développement d’un système de régulation de l’expression de shARN inductible par la tétracycline et sa vectorisation. Problème de l’immunogénicité du transactivateur pour utilisation clinique

40. Perspectives pour une utilisation clinique • Se tourner vers un système de régulation d’origine humaine ou « humanisé » pour la clinique • Rapamycine • ZFP synthétique • Régulation Physiologique • La régulation en cas de complication • Alternatives :excision du vecteur ou suicide des cellules transduites