Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali

1. Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali Tesi di Laurea Magistrale in Biotecnologie Genomiche “Analisi bioinformatica dell'esoma in pazienti con Spina Bifida: caratterizzazione funzionale di alcune varianti in geni candidati” Candidata Calà Palmarino Francesca Maria Relatore Interno Relatore Esterno Prof. Negri Rodolfo Prof.ssa Gurrieri Fiorella Anno Accademico 2013/2014

2. I Difetti del Tubo Neurale(Neural Tube Defects o NTDs) • Anomalie congenite del SNC causate da una chiusura parziale del tubo neurale ( 18°- 27° giorno dal concepimento) • Incidenza di 1- 2 /1000 nati vivi • Causa di 1/20 aborti spontanei Mesoderma ed Ectoderma

3. Sviluppo del Tubo Neurale nei vertebrati (Copp et al., 2009). La chiusura del tubo neurale avviene durante la gastrulazione primaria in modo sequenziale e a diversi livelli rispetto all’asse del corpo. • Mancata chiusura 1: Cranioraschisi incompatibile con la vita • Mancata chiusura 3: Spina Bifida aperta compatibile con la vita

4. Eziologia dei DTN Fattori non genetici • Esposizione ai farmaci : Acido Valproico (VPA), Carbamazepina e Fumosina. • Iperglicemia, Ipertermia ed Obesità materna • Età materna • Carenza di micronutrienti:Inositolo, Vitamina B12, Zinco e Acido Folico

5. Fattori genetici e meccanismi molecolari implicati nella patogenesi della SB • Pathway Polarità Cellulare Planare (PCP) • Pathway Hedgehog • Apoptosi

6. La Spina Bifida (SB) Difetto di chiusura del neuroporo posteriore fuoriuscita di meningi e midollo in corrispondenza della soluzione di continuo. SB APERTA: Il canale spinale rimane aperto. Le meningi ed il midollo spinale protendono e sono contenute in una sacca sporgente a livello lombare; i tessuti ed i nervi sono esposti (26°-30°) Malformazione della parte caudale del midollo che si sviluppa come difetto di chiusura dell'arco vertebrale (28° - 42° ). È innocua ed asintomatica. Le vertebre si sviluppano normalmente ma le meningi sono incastrate nello spazio intravertebrale (23° - 26° ). È la variante più rara.

7. Scopo della tesi Identificare varianti genomiche predisponenti alla SB sfruttando nuove tecnologie high-throughput: sequenziamento dell’esoma di un gruppo di pazienti, analisi bioinformatica e funzionale delle varianti genomiche identificate. 1) Analisi esomica con piattaforma di sequenziamento di nuova generazione (NextGeneration Sequencing-NGS): Illumina/Solexa. Service IGA Udine 2) Analisi di dati e selezione di geni di suscettibilità alla SB (TNIP1 e KCNV1). 3) Analisi bioinformatica delle mutazioni. 4) Studi funzionali delle varianti selezionate.

8. Analisi bioinformatica delle varianti identificate dall’analisi di 7 esomi di pazienti e 2 coppie di genitori Le varianti non sinonime di DIP e SNP sono state filtrate escludendo quelle presenti nel 1000Genomes e dbSNP135, dando priorità a quelle patogenetiche o potenzialmente dannose in SIFT e PolyPhen; Selezionati geni con mutazioni apparentemente condivise da più di 4 pazienti che poi sono risultate essere falsi positivi. Un gene con mutazioni diverse in due pazienti (Pz 36 e Pz 93) Selezione delle mutazioni de novo analisi bioinformatica con Génie Pz 36: 76 geni mutati, selezionati 14 per l’analisi mutazionale. Pz 93: 9 geni, 6 con mutazioni esoniche.

9. Analisi mutazionale mediante metodo di Sanger • 2 a carico di uno stesso gene, TNIP1, in 2 pz diversi ( pz36 e pz93) • 1 a carico del gene KCNV1 (pz 36)

10. Analisi mutazionale mediante metodo di Sanger Pz 36 36M 36F 36P TNIP1 Ex 11 c.T1089G p.F363L Pz 93 93M TNIP1 Ex 17 c.C1781T p.P594L

11. Analisi mutazionale mediante metodo di Sanger Pz 36 36M 36F 36P KCNV1 Ex 3 c.A1388C p.Y463S

12. Valutazione della patogenicità delle mutazioni identificate utilizzando PolyPhen-2, AVSIFT e PMut

13. Studi bioinformatici sulle modifiche della proteina KCNV1 KCNV1 wt Pz 36 KCNV:c.A1388C; p.Y463S La mutazione colpisce solo un dominio adiacente alla sostituzione aminoacidica, non influenzando il folding dell'intera proteina

14. Studi bioinformatici sulle modifiche della proteina TNIP1 TNIP1 wt Pz 36 TNIP1 ex 11: c.T1089G:p.F363L La mutazione non sinonima determina un cambiamento significativo nel folding della proteina.

15. Studi bioinformatici sulle modifiche della proteina TNIP1 TNIP1 wt Pz 93 TNIP1 ex 17: c.C1781T; p.P594L La mutazione non sinonima determina un cambiamento significativo nel folding della proteina.

16. QRT-PCR su mRNA da linea cellulare linfoblastoide Lieve riduzione di espressione nel paziente rispetto ai suoi genitori non affetti, ma non significativo. Uguale espressione del gene sia nel paziente che nei genitori non affetti.

17. Studi di espressione di TNIP1 su cDNA umano • Studio delle porzioni costanti delle diverse isoforme (19) delle proteine • Primers delimitanti la regione in cui è presente la mutazione (tra esone 8 e 12, 165 bp) • Studi su midollo spinale di feto di 29 settimane NESTED-PCR amplificato corto: bande visibili L’RNA messaggero di TNIP1 è espresso in linee cellulari linfoblastoidi di Trio 1 (Paziente, Madre e Padre) e nel midollo spinale di un feto di 29 settimane.

18. Studi di espressione proteica Immunoistochimica per TNIP1 e KCNV1 su midollo spinale e cervello di prematuro di 29 settimane e ctrl negativo. Entrambi i geni sono altamente espressi soprattutto negli assoni dei motoneuroni e nel soma

19. Analisi mutazionale mediante metodo di Sanger Testati i 17 esoni del gene TNIP1 in 25 pazienti KCNV1 in 25 pazienti

20. Studi del gene TNIP1 TNIP1 (TNF-α induced proteine 3 (TNFAIP3)-interacting protein 1) localizzato nella regione 5q32-q33, codifica per un fattore di regolazione implicato in molte vie di segnale. TNIP1 inibisce l’attivazione di NF-kB prevenendo la poliubiquitinazione di NEMO e il processamento di p105 TNIP1 impedisce il reclutamento della caspasi 8 sul complesso II e quindi la cascata del segnale apoptotico TNIP1 esercita il suo effetto inibitorio sia sui recettori PPAR sia RAR

21. Studio del gene KCNV1 • Il gene KCNV1 (Kv 8.1) è localizzato nella regione 8q22.3-8q24.1 ed è membro della sottofamiglia V potassio voltaggio dipendenti • Controllo del potenziale di riposo, di membrana e la frequenza di potenziale d'azione ma alla sua attivazione nn è associata alcuna corrente K+: inibisce la funzione di una particolare classe di tipi di canali raddrizzatore di potassio verso l'esterno, come Shab (KV2) e Shaw (KV3) • È espresso nel cervello, negli strati I, IV e VI della corteccia cerebrale, nell'ippocampo, in CA1-CA4 strato di cellule piramidali, nonché nelle cellule granulari del giro dentato, nello strato di cellule dei granuli e nello strato di cellule di Purkinje del cervelletto. La disregolazione del gene KCNV1 può influenzare il tessuto danneggiato nei DTN.

22. Conclusioni • Lo scopo del nostro lavoro è stato quello di applicare le nuove tecnologie di NGS per individuare fattori genetici di suscettibilità alla Spina Bifida • Sono state identificate 3 mutazioni de novo in 2 geni TNIP1 e KCNV1 (un paziente presenta una mutazione a carico del gene TNIP1 ed una mutazione a carico del gene KCNV1) • Entrambi i geni sono espressi nel SNC e non sono stati precedentemente correlati con DTN • Non sono presenti mutazioni in una piccola coorte di pazienti con Spina Bifida, ma la numerosità del campione andrebbe aumentata data l’eterogeneità eziologica del difetto in esame • Se uno o entrambi i geni dovessero risultare effettivamente geni di suscettibilità, indicherebbero dei nuovi pathways la cui disfunzione predisporrebbe alla Spina Bifida.

23. Grazie per l'attenzione