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Universit à degli Studi di Napoli Federico II

Universit à degli Studi di Napoli Federico II. FACOLTÀ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI DOTTORATO DI RICERCA IN SCIENZE CHIMICHE. Sintesi e purificazione di un inibitore della trombina. Candidata : Valeria Turco . Coagulazione del sangue. Trombina. Sito catalitico.

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Presentation Transcript

  1. Università degli Studi di Napoli Federico II FACOLTÀ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI DOTTORATO DI RICERCA IN SCIENZE CHIMICHE Sintesi e purificazione di un inibitore della trombina Candidata : Valeria Turco

  2. Coagulazione del sangue

  3. Trombina Sito catalitico Exo sito CS ES Hirudina 40 aa Ile-Thr-Tyr-Thr-Asp-----------------------Pro-Glu-Ser-His-Asn-Asx-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln Chg-Arg-Nal-Thr-Asp-DAla-ßAla-ßAla-Pro-Glu-Ser-His-Phe-Gly-Gly-Asp-Tyr-Glu-Glu-Ile-Pro-Aib-Aib-Tyr-Cha-DGlu Hirunorm IV Inibitore della trombina

  4. Trombina Sito catalitico Exo sito CS peptide ES peptide porfirina TAMPP Inibitore della trombina H-Chg-Arg-2Nal-OH CS3 HO-Succ-Pro-Glu-Tyr-Asp-Pro-Chg-OH ES7

  5. H N 2 H - C h g - A r g - 2 N a l - N H N H N CS ES N N H - S u c c - P r o - G l u - T y r - A s p - P r o - C h g - O H N H N H 2 CS3-TAMPP-ES7

  6. Fasi sperimentali • Sintesi dell’inibitore • Purificazione • Inserzione del metallo

  7. H H 2 2 N N H H 2 2 N N H H N N H H N N 2 2 N N N N N N H H N N H2 H- 2Nal-Arg-Chg-H CS3-TAMPP-CS3 CS3-TAMPP TAMPP Primo peptide + peptide CS3 TAMPP CS3-TAMPP

  8. H H 2 2 N H 2 N H N H N 2 N H N N N H - S u c c - P r o - G l u - T y r - A s p - P r o - C h g - O H N H N N H 2 N N N H N H- 2Nal-Arg-Chg-H N H- 2Nal-Arg-Chg-H peptide ES7 CS3-TAMPP-ES7 CS3-TAMPP Secondo peptide + peptide ES7 CS3-TAMPP CS3-TAMPP-ES7

  9. Inserzione metallo H H 2 2 N H N H N 2 MnAc2 N N N N H H - - S S u u c c c c - - P P r r o o - - G G l l u u - - T T y y r r - - A A s s p p - - P P r r o o - - C C h h g g - - O O H H N H N H N N 2 MnIII N N N N H- 2Nal-Arg-Chg-H N H- 2Nal-Arg-Chg-H Applicazione in diagnostica: rivelazione dei trombi

  10. Inserzione metallo H H 2 2 N H N H N 2 MnAc2 N N N N H H - - S S u u c c c c - - P P r r o o - - G G l l u u - - T T y y r r - - A A s s p p - - P P r r o o - - C C h h g g - - O O H H N H N H N N 2 MnIII N N N 22.13 min 400 22,13 min N H- 2Nal-Arg-Chg-H mAU mAU 200 N H- 2Nal-Arg-Chg-H 0 200 400 600 800 nm 22,86 min mAU

  11. HPLC: Minutes Spettro di massa: 1: 210 nm, 8 nm 210 nm 100 Mn-trans pulito 25-11-06 400 400 22.13 min 100 Mn-trans pulito 25-11-06 mAU 200 200 0 0 10 15 20 25 30 2117.3 (M) 7520.9 100 90 80 70 60 % Intensity 50 40 30 20 1862.80 2182.97 10 2088.11 1977.23 2205.44 2049.96 0 0 1332.0 1665.2 1998.4 2331.6 2664.8 2998.0 Mass (m/z) Purificazione MnIII-CS3-TAMPP-ES7

  12. Conclusioni • E’ stato sintetizzato e purificato un nuovo inibitore della trombina, costituito da una porfirina che porta due peptidi diversi. • E’ stato inserito uno ione metallico all’interno dell’anello porfirinico. • Il complesso metallo-inibitore potrebbe trovare un’applicazione nel campo della diagnostica.

  13. Interazione con la trombina legata ai coaguli • Formazione dei coaguli • La molecola sintetizzata lega in vitro coaguli di fibrina e ne inibisce la crescita Coagulo di fibrina Coagulo di fibrina + inibitore

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