Anno Accademico2013/2014

1. Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali Laurea Magistrale in Neurobiologia Nuovi metodi per la quantificazione in vitro dei prioni: l’applicazione dell’acido retinoico allo Scrapie CellAssay Anno Accademico2013/2014

2. Le Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili (EST) oMalattie da Prioni • Gruppo di malattie neurodegenerative che colpiscono sia l’uomo che gli animali • Trasmissibilità • Decorso clinico progressivo ad esito costantemente fatale • Assenza di reazioni immunitarie ed infiammatorie • Lesioni esclusive del SNC di tipo regressivo • Degenerazione neuronale • Astrocitosi • Degenerazione spongiforme del neuropilo • Presenza di vacuoli • Placche amiloidi • Attivazione microglia SINTOMI: debolezza; riduzione dell’appetito e del sonno; depressione; allucinazioni; perdita di memoria; disturbi visivi

3. L’Ipotesi “ProteinOnly” dei Prioni PrPC PrPSc 43% α-helix 3% β-sheet 30% α-helix 43% β-sheet Insolubile Solubile Parzialmente resistente (PrP27-30) Sensibile L’agente infettivo è una proteina misfolded che si trasmette in assenza di acidi nucleici per trasmissione del folding alterato alla versione normale della proteina endogena. La proteina endogena SI CONVERTE attraverso un processo di misfolding in quella patologica, infettiva e neurotossica (Prusineret al., 1982) Turn-over lento Si accumula Rapido turn-over Non si accumula

4. Processo di Conversione 1) Ripiegamento dipendente dallo stampo PrPC PrPSc Eterodimero Omodimero Amiloide 2) Nucleazione PrPC Equilibrio PrPSc Formazione dello stampo Reclutamento monomeri PrPSc Seme infettivo Frammentazione in particelle infettive Amiloide (Aguzzi et al., 2001)

5. Critiche all’ Ipotesi “Proteinonly ” Riprodurre l’infettività in vitro tramite sintesi della proteina patologica ricombinante 1) Frammenti di proteina prionica ricombinante in E.Coli e creazione prioni sintetici (Legname et al., 2004) 2) Sostanziali differenze nelle strutture di prioni naturali e artificiali in seguito Diffrazione raggi X (Willeet al.,2009) 3) Non fornisce una spiegazione di ceppi multipli di prioni, cioè isolati infettivi con caratteristiche persistenti dopo trasmissioni seriali nella stessa specie (Bruce et al., 1991) 4) Rinnovato interesse per Ipotesi Virale: l’infettività può essere separata dalla PrPSc Ipotesi unificata: le caratteristiche del ceppo dipendono dal COPRIONE e dall’APOPRIONE (Weissmann, 1991) La corretta identificazione dell’agente infettivo è limitata dalla mancanza di metodi sensibili per la quantificazione dell’infettività prionica

6. Quantificazione Titolo Infettivo L’infettività è quantificata IN VIVO: BIOASSAY (Reed & Muench,1938) IN VITRO: SCRAPIE CELL ASSAY (Klohnet al., 2003) - saggio cellulare per l’infettività prionica - tempo di incubazione - end-point - cellule altamente suscettibili VANTAGGI: -standardizzato -analisi differenti ceppi prionici LIMITI: -tempi lunghi -costi elevati -animali sacrificati • LIMITI: • numero ridotto di linee cellulari suscettibili a differenti ceppi prionici VANTAGGI: - etico - rapido - economico

7. LO SCRAPIE CELL ASSAY Suddiviso in: Infezione con diluizioni seriali di omogenato cerebrale Divisioni cellulari (n=3) per la propagazione dell’infettività Saggio immunocolorimetricoELIspot SCEPA versione end-point del protocollo dello Scrapie CellAssay 20x Quantificazione delle cellule positive a PrPSc Risposta proporzionale alle dosi iniziali di prioni Mancanza di una linea cellulare suscettibile ai prioni umani (Klohnet al., 2003)

8. Procedura Standard di Subcloning Linee cellulari suscettibili ai prioni murini: PK1, CAD5, LD9, R33 picking 50cellule/piastra Aliquota cellulare Piastra a 96 pozzetti OC 139A SCA NI

9. METODIL’Acido Retinoico • Classe dei retinoidi (vitamina A) • Regolatore fisiologico di processi biologici Prioni Acido Retinoico Differenziamento cellulare Il trattamento con acido retinoico in cellule di neuroblastoma murino altamente suscettibili ai prioni ne aumenta la suscettibilità (Bateet al., 2004)

10. Scopo del Lavoro Implementare un nuovo protocollo per la selezione di cloni cellulari altamente suscettibili ai prioni murini Ottimizzare la procedura di subcloning mediante l’applicazione di Acido Retinoico (RA) Il piano della ricerca è stato suddiviso in due parti: 1) Creazione e selezione di cloni suscettibili: protocollo di “subcloning” a partire dalla linea cellulare PK1 (Neuroblastoma murino) 2) Caratterizzazione dei cloni suscettibili: cloni selezionati dopo SCA e sottoposti ad analisi tramite Western Blot

11. 1)Valutazione degli effetti dell’acido retinoico applicato durante l’infezione nello Scrapie CellAssay e End Point Scrapie CellAssay Risultati • A parità di numero di spot la sensibilità del test aumenta di metà e di una unità logaritmica per i campioni trattati rispettivamente con 5 e 10 µM • I valori di unità infettive non hanno mostrato differenze significative in nessuno dei gruppi testati

12. 1) Immunofluorescenza per la visualizzazione della PrPC nelle cellule PK1 trattate con o senza acido retinoico PK1 controllo PK1 con RA 10 µM 10 µm • Le cellule trattate con RA hanno una morfologia multi e bipolare rispetto a quelle di controllo che sono prevalentemente bipolari • Tutte le cellule osservate sono immunopositive, i controlli, con solo secondario, sono negativi • Non si apprezzano differenze di intensità di fluorescenza nei due gruppi trattati

13. 2) Ottimizzazione della procedura di subcloning per la selezione di nuovi cloni cellulari PK1 mediante acido retinoico -RA +RA OC 139A OC 139A +SCA -SCA -SCA +SCA Selezione dei cloni 3B 6D 12A 11A 11H Selezione dei cloni 3B+RA 6D+RA 12A+RA 11A+RA 11H+RA Read-outELIspot Read-outELIspot

14. 2) Scrapie CellAssay dei Cloni derivanti dal “Picking” Cloni provenienti dal sottoclonaggio della linea cellulare PK1 100 µm L’analisi immunocolorimetricaELIspot ha evidenziato: - 25 cloni sono risultati maggiormente suscettibili dopo trattamento con RA - 5 cloni hanno mostrato un numero di spots più alti Il criterio di selezione ha previsto la scelta dei cloni maggiormente differenziati poiché, come è noto, più responsivi ai prioni (Bosque et al., 2000; Mahalet al., 2007)

15. 2) Scrapie CellAssay dei cloni PK1 maggiormente suscettibili 5 cloni testati con le rispettive repliche, trattate con RA 10 µM Il numero di spots è proporzionale alla dose iniziale di inoculo in tutti i cloni testati I cloni trattati con RA mostrano un numero maggiore di spots positivi Due cloni (3B+RA;12A+RA) presentano un numero di spots più significativo rispetto alle PK1

16. 2) Scrapie CellAssay dei nuovi cloni selezionati I nuovi cloni 3B e 12 A sono stati testati nuovamente allo SCA, dopo congelamento/scongelamento, per avere conferma della loro elevata suscettibilità • Conferma dell’aumentata suscettibilità dei cloni cellulari in presenza di retinoico • Conferma della maggiore suscettibilità dei cloni rispetto alle cellule PK1s originali • Dimostrazione dell’efficacia del nuovo metodo di subcloning testato nel promuovere i fattori di suscettibilità

17. 3) Rivelazione della proteina prionica cellulare nei nuovi cloni selezionati Valutazione della presenza di eventuali differenze nel pattern elettroforetico e nei livelli di PrPC dei cloni selezionati • A parità di proteine totali caricate (10 µg) in ogni pozzetto, la PrP presenta livelli diversi • Nei cloni trattati con RA l’intensità delle bande di PrPC sembra essere ridotta • Nei cloni non trattati con RA la PrPC è ben evidente, con un peso molecolare di 30-35kDa (Marbiahet al., 2014)

18. Conclusioni • L’ Acido Retinoico applicato durante lo Scrapie CellAssay aumenta la suscettibilità all’infezione prionica delle cellule trattate di metà e un’unità logaritmica (Klohnet al., 2003) • L’applicazione dell’ Acido Retinoico alla procedura di subcloning ha permesso di selezionare due cloni (3B,12A) maggiormente suscettibili ai prioni murini, rispetto ai cloni non trattati e alle PK1, anche dopo procedure di congelamento/scongelamento • I cloni risultati più suscettibili all’infezione prionica, in seguito al trattamento con Acido Retinoico, mostrano livelli inferiori di proteina prionica cellulare rispetto ai cloni non trattati e alle PK1 originali TAKE HOME MESSAGE • Questo nuovo protocollo di subcloning potrebbe essere applicato alla selezione di cellule umane suscettibili ai prioni

19. Ringraziamenti Prof. Maurizio Pocchiari Dott.ssa Anna Ladogana Dott.ssa Francesca Properzi Dott. Franco Cardone ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA’ UNIVERSITA’ SAPIENZA Dott.ssa HaninAbdel-Haq Massimo Venditti Eugenia, Elena,Gabriele, Ilenia, Ramona Prof.ssa Maria Egle De Stefano RINGRAZIO TUTTI VOI PER L’ATTENZIONE

20. Prospettive future • Cercare di ottimizzare ulteriormente il protocollo di subcloning nella speranza di renderlo applicabile anche alle cellule umane in coltura • Co-infettare le cellule con RA in associazione ad altri agenti biologici (Moloney murine Leukemia Virus)(Leblancet al., 2012) ai fini di un’aumentata suscettibilità dei cloni all’infezione prionica • Quantificare l’agente infettivo in vitro sarebbe importante per la realizzazione di un metodo diagnostico e un piano terapeutico che ancora mancano