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Università degli Studi di Genova

INFM Istituto Nazionale per la Fisica della Materia. Università degli Studi di Genova. Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali - Corso di Laurea in Fisica. Analisi a due fotoni dell’accumulo di ioni divalenti in colture cerebellari di ratto. Genova, 9 Ottobre 2002.

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Presentation Transcript

  1. INFM Istituto Nazionale per la Fisica della Materia Università degli Studi di Genova Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali - Corso di Laurea in Fisica Analisi a due fotoni dell’accumulo di ioni divalenti in colture cerebellari di ratto Genova, 9 Ottobre 2002 Prof.Mauro Robello Dott.sa Carla Marchetti Relatori: Correlatore: Prof.Maurizio Canepa Candidato: Alessandro Esposito IBF - CNR Istituto di Biofisica Consiglio Nazionale delle Ricerche

  2. Introduzione TPM Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni Ca2+ Il calcio, secondo messaggero Pb2+ Il piombo, interferisce con alcune funzioni del calcio Meccanismi di permeazione Azione del piombo Pb2+ Pb2+ Ca2+ Importanza degli ioni divalenti Ca2+ e Pb2+ Genova, 9 Ottobre 2002 Ca2+ Pb2+ H.A.Godwin, “The Biological Chemisrty of Lead”, Current Opinion in Chemical Biology 5, 223-227 (2001) M.Mazzolini,S.Traverso,C.Marchetti, “Multiple pathways of Pb(2+) […]”, J.Neurochem.2001 Oct;79(2):407-16 2

  3. Introduzione TPM Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni Ca2+ Ca2+ Ca2+ Modello biologico neuroni cerebellari di ratto • Caratterizzazione: • Microscopia in fluorescenza con • eccitazione a due fotoni (TPM) • sonda fluorescente permeabile • alla membrana: Indo-1 Genova, 9 Ottobre 2002 A.Periasamy, “Methods in Cellular Imaging”, Oxford University Press (2001) A.Takahashi […] and B.Herman, “Mesurement of Intracellular Calcium”, Physiol.Review Vol.79 No4 (1999) 3

  4. Introduzione TPM Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni (Teoria perturbativa al second’ordine) ~350nm E1 Eccitazione a singolo fotone CLSM E0 Microscopia a due fotoni TPLSM Selezione del piano focale durante l’eccitazione Utilizzo di radiazione rossa e nel vicino infrarosso anziché Vis-UV Microscopia a due fotoni Microscopia in fluorescenza a scansione laser Genova, 9 Ottobre 2002 J.J. Sakurai, “Modern Quantum Mechanics”, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. (1985) Max Born and Emil Wolf, “Principles of Optics”, Pergamon Press (1970) 4

  5. Introduzione TPM Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni Luce IR-NIR per eccitare sonde Vis-UV Minore fototossicità e fotodanneggiamento Confocalità Risoluzione Assiale: 700nm Laterale:250nm Temporale: 3s/pxl Analisi delle distribuzioni di fluorescenza nello spazio (3D) e nel tempo Sezioni ottiche Lunghezza d’onda: 700nm (680-1050nm) Potenza media sul campione: 5-7mW (0-70mW) Laser pulsato: 80MHz ; 100-200fs 2m superfici volumi Caratteristiche rilevanti della TPM Genova, 9 Ottobre 2002 A.Diaspro, “Confocal and Two-Photon Microscopy”, Wiley-Liss (New York, 2002) F.M. Wahl, “Digital Image Signal Processing”, Artech House (1987) 5

  6. Introduzione TPM Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni Microscopio TE300Eclipse (Nikon) PMT1 PMT2 TPM: apparato sperimentale Testa di Scansione (PCM2000) Genova, 9 Ottobre 2002 Filtro neutro Tsunami Millennia A.Diaspro […] and M.Robello (1999b), “Adapting a compact confocal […]”, Microsc. Res. Tech. 47, 196-205 A.Diaspro […] M.Robello and F.Olivini (2001), “Two-photon microscopy […]”, J.Biomed.Opt. 6

  7. Introduzione TPM Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni Perfusione e soluzioni Misure di calcio intracellulare: Depolarizzazione (KCl75mM) Acido N-metil-D-aspartico100M (NMDA) Misure di accumulo di piombo: Piombo (20M) Lantanio (25M) Genova, 9 Ottobre 2002 7

  8. Introduzione TPM Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni HQ405/30 HQ485/30 Fotodanneggiamento e perdita di sonda Disomogeneità della marcatura  Concentrazioni assolute di calcio Ca2+ Proprietà spettrali dell’Indo-1: misure raziometriche Genova, 9 Ottobre 2002 G.Grynkiewicz, M.Poenie and R.Y.Tsien, “A New Generation of Ca2+ Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties”, The Journal of Biological Chemistry Vol.260 No.6 25th March 1985 3440-3450 8

  9. Introduzione TPM Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni Rapporto 405nm/485nm Indo-1 libero (485nm) Indo-1 legato (405nm) 1m controllo 0 183 Intensità (a.u.) NMDA (100M) 0 0 2.0 250 Rapporto (a.u.) Intensità (a.u.) Immagini raziometriche Genova, 9 Ottobre 2002 9

  10. Introduzione TPM Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni Intensità di fluorescenza (a.u.) Rapporto 405nm/485nm KCl (75mM) NMDA(100M) Sonda legata (405nm) Sonda libera (485nm) Rapporto Tempo (s) Misure raziometriche Genova, 9 Ottobre 2002 10

  11. Introduzione TPM Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni HQ460/50 Non è più una sonda raziometrica Stimare la concentrazione di sonda Stimare il fotodanneggiamento della sonda Pb2+ Proprietà spettrali dell’Indo-1: quenching Genova, 9 Ottobre 2002 M.E.Legare, R.Barhoumi, E.Hebert, G.R.Bratton, R.C.Burghardt and E.Tiffany-Castiglioni, “Analysis of Pb2+ Entry into Cultured Astroglia”, Toxicological Sciences 46, 90-100 (1998) 11

  12. Introduzione TPM Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni Ricostruzione 3D e sezionamento virtuale di un neurone marcato tramite micropipetta. 0 255 Intensità (a.u.) 5mm Marcatura tramite micropipetta Micropipetta con Indo-1 100mM Genova, 9 Ottobre 2002 La sonda diffonde piuttosto velocemente nel citoplasma. Indo-1 100mM fornisce misure di intensità di fluorescenza prossime a quelle osservate con la la marcatura tramite diffusione da membrana Brust-Mascher and Webb, “Calcium Induced by Large Voltage Pulses in Fish Keratocytes”,Biophy.J. Vol75 1998 12

  13. Introduzione TPM Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni 6115M 5411M Permeazione del piombo Genova, 9 Ottobre 2002 13

  14. Introduzione TPM Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni Pb2+ La3+ Inibizione del lantanio Genova, 9 Ottobre 2002 14

  15. Introduzione TPM Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni 4411pM Piombo legato:6115M e probabile saturazione del trasporto Piombo libero: 4411pM Parziale inibizione del lantanio Analisi dell’accumulo di piombo Genova, 9 Ottobre 2002 R.H.S.Westerink and Henk P.M.Vijverberg, “Ca2+-indipendent vesicular catecholamine release in PC12 cells by nanomolar concentrations of Pb2+”, Journal of Neurochemistry, 2002 Vol.80 861-873 15

  16. Introduzione TPM Misure Ratiometriche Misure di Quenching Conclusioni Studio delle tecniche raziometrica e del quenching Analisi delle variazioni di concentrazioni di calcio Probabile saturazione del trasporto del piombo Inibizione del lantanio Caratterizzazione dell’autofluorescenza, fotodanneggiamento e spettri dell’Indo-1 Elaborazione di codici (Matlab – VisualBasic) per l’elaborazione ed analisi (3D-t) delle immagini, l’assistenza all’acquisizione Conclusioni Genova, 9 Ottobre 2002 Per approfondimenti: http://www.fantagp.net/alessandro/research/ 16

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