Oh, natura, natura… Il punto di vista della tossicologia

1. Oh, natura, natura…Il punto di vista della tossicologia Control is the sense of biology ovvero Fare sempre il paragone con la vita reale

2. Con l’esplodere della chimica di sintesi nella seconda metà del secolo appena passato, si incominciò ad avere timore per il gran numero e quantità di sostanze nuove che venivano introdotte nell’ambiente e nell’alimentazione. Dati fine anni 80 Nuove sostanze approvate dalle industrie in US+UE+JP = 2500 / anno

3. ? Chimica di sintesi  cancro Quei numeri suscitavano (e suscitano) paura perché si aveva evidenza di correlazione tra cancro e mutazioni (il 90% dei mutageni sono anche cancerogeni) Come si fa a dire se una sostanza è tossica? Test tossicologici: tossicità acuta o cronica, per ingestione, contatto, inalazione… Un test molto utile per identificare una classe di sostanze molto pericolose (i mutageni) è stato inventato dal prof. Bruce Ames più di 30 anni fa.

4. Il test (detto anche della salmonella) è semplice, veloce, efficace (non perfetto!), a basso prezzo e facile da eseguire A  B  C  D  His A  B A  B  C  D  His Si basa sul recupero di funzionalità di geni di Salmonella necessari per la sintesi dell’istidina (un aminoacido). Vi sono diverse mutanti di Salmonella in cui i geni hanno cause diverse per la mancata funzionalità. Ciascuna variante possiede una diversa sensibilità ai vari tipi di mutazione (e quindi ai vari tipi di mutageno). * TA100 è sensibile alla reversione per sostituzione di basi * TA1535 e TA1538 sono sensibili alla reversione per frameshift (introduzione di una diversa fase di lettura del gene) e quindi alle inserzioni o delezioni

5. Controllo con Istidina (dil 10000) Controllo + mutageno diretto Il disco di carta da filtro è stato impregnato con 10µg di 2-aminofluorene, un cancerogeno Test di Ames o della Salmonella Salmonella typhimurium (e.g. TA100) his- Terreno senza Istidina Capsula Petri con terreno nutritivo Revertanti indotti dal mutageno Revertanti spontanei

6. Control is the sense of biology Risultato del test di Ames su EMS e MMS (mutageni diretti)

7. Mutageni diretti Esempio di test di Ames su Aflatossina B1 (mutageno diretto). Il ceppo TA 100 risulta evidentemente il più sensibile a questo tipo di mutageno, mentre il ceppo TA1535 è insensibile. La rivelazione dipende dal ceppo! TA100  BPS 1535 & 38  FS

8. Terreno con istidina (dil. 10000 volte) Controllo + mutageno diretto mut. indiretto S9 (fraz fegato) S9 +mut. ind. Test di Ames con frazione S9 Salmonella typhimurium (e.g. TA100) his- Terreno senza istidina Capsula Petri con terreno nutritivo Revertanti spontanei

9. Si noti il controllo con l’estratto S9, la salmonella (BPS o FS), ma senza la sostanza X Master APRA (2006)

10. Esempio di mutageni indiretti Risultato di un test di Ames su Ciclofosfamide (mutageno indiretto) con e senza attivazione microsomale (aggiunta estratto S9)

11.  La mutagenicità (tossicità) di una particolare sostanza non è una cosa assoluta e intrinseca per la sostanza stessa I mutageni indiretti vengono rivelati solo in presenza dell’estratto di fegato di ratto (frazione microsomale) che contiene enzimi attivanti (e.g. Citocromi P450) e di particolari ceppi di salmonella. Test di Cancerogenicità: test di tossicità cronica Durata 2 anni, eseguito in genere per ingestione a dosi sotto la MTD (Massima Dose Tollerata, dose che non causa decremento ponderale). Alla fine dei due anni si sacrificano gli animali e si esamina se il numero di tumori è più alto rispetto al gruppo di controllo

12. Validità generale? Se una sostanza è mutagena per la salmonella lo sarà anche per il nostro organismo? (La validità di questa osservazione può essere estesa anche agli altri organismi?) Se una sostanza non è mutagena per la salmonella possiamo dedurre che non sarà mutagena in nessun caso? Se una sostanza è cancerogena per il topo possiamo dedurre che sarà cancerogena per tutti i roditori o mammiferi? Domanda più generale: i risultati ottenuti con un animale (batterio, pianta…) possono essere estesi ad altri animali? La tossicità dipende dalla via di assunzione, tempo, dose, organismo, stadio di sviluppo, presenza di altre sostanze...

13. Test LD50: tossicità acuta Erbicidi a bassa tossicitàLD50 mg/kg Dati ottenuti in ratto/topo: * Glyphosate >10.000 * Aspirina+1.100 * Solfato di rame 472 * Caffeina+200 * 2,4D 370 +non sono erbicidi; mostrati per paragone C’è chi sostiene l’inutilità di tutte le prove tossicologiche sugli animali (variabilità LD50 e falsi positivi)

14. Nicotina The fatal dose of pure nicotine is approximately 40-60 mg (0.6-1.0 mg/kg, 1-2 drops). La quantità contenuta in 2 g di tobacco (equivalenti a 2 sigarette; 15-25 mg di nicotine per sigaretta). Il fumo contiene meno di 3 mg per sigaretta. Il fumo di sigarette senza filtro contiene1.2-2.4 mg, quelle con filtro 0.2-1.0 mg. ORL-RAT LD50 50 mg kg-1 IPR-MUS LD50 5.9 mg kg-1 SKN-RBT LD50 50 mg kg-1 IVN-MUS LD50 0.8 mg kg-1 SKN-RAT LD50 140 mg kg-1 LD50 nicotine http://physchem.ox.ac.uk/MSDS/NI/nicotine.html Children The lethal dose is considered to be about 10 mg of nicotine (Arena, 1974). 7.2.2 Relevant animal data Dog: oral LD50: 9.2 mg/kg mouse: oral LD50: 3.3 mg/kg (RTECS, 1985-86) rat: oral LD50: 50 mg/kg http://www.inchem.org/documents/pims/chemical/nicotine.htm

15. Iron tablet poisoning Accidental overdose of iron pills is a leading cause of poisoning deaths among young children Since 1986, poison control centers in the United States have received reports of more than 110,000 incidents of children under 6 accidentally swallowing iron tablets. Some of the children were hospitalized; more than 35 died. Symptoms of iron overdose will appear when doses greater than 10mg/Kg (of the child’s weight) are taken. For example, for a child weighing 20 Kg, ingesting 180mg of iron would cause symptoms of iron poisoning to appear. The RDA for iron in children ranges from about 7-10mg per day. http://www.kidsgrowth.org/resources/articledetail.cfm?id=1895

16. La quantità: indice affidabile del rischio? Rischio = Tossicità X Esposizione Per es.: glyphosate, tossicità bassa per quasi tutte le specie. L’esposizione potenziale è anche molto bassa. ORL-RAT LD50 891 mg kg-1 ORL-MUS LD50 480 mg kg-1 IHL-MAM LC50 > 300 mg m-3 LD50 Salicylic acid http://ptcl.chem.ox.ac.uk/MSDS/SA/salicylic_acid.html Per tutte le sostanze è opportuno esaminare la tossicità, la modalità di assunzione e l’esposizione. Chiaramente la discussione degli effetti di una sostanza sull’ambiente riguarda anche altre scienze.

18. Il 60 % dei composti sintetici risultano cancerogeni nei test ad alta dose in topo e ratto Il 57 % dei composti naturali risultano cancerogeni nei test ad alta dose in topo e ratto

19. CH N CH2 S H2C Sostanze naturali positive al test: (cancerogeni nei test ad alta dose) Estragolo: presente nel basilico e quindi nel pesto Isotiocianato di allile: presente in cavolo, cavolfiore, mostarda, rafano…

20. Tabella 2 - elenco di alcuni pesticidi naturali che sono carcerogeni nei roditori (escluse tossine fungine): acetaldeide, metilformilidrazone, allil isotiocianato, idrocloruro di arecolina, benzaldeide, acetato di benzile, acido caffeico, catecolo, cumarina, aldeide crotonica, acrilato di etile, esanale, metil formilidrazina, idrochinone, D-limonene, 8-metossipsoralene....... Per I dati completi si veda la pubblicazione Bruce N. Ames and Lois Swirsky Gold (2000) Paracelsus to parascience: the environmental cancer distraction. Mutation Research 447: 3-13. Questi composti carcinogeni sono presenti in: aglio, albicocca, ananas, aneto, anice, anice stellata, arancia, assenzio, banana, basilico, bietola, broccoli, cacao, caffè, cannella, cardamomo, carota, cavolfiore, cavolini di Bruxelles, cavolo, chiodi di garofano, ciliege, cipolla, coriandolo, cumino, curcuma, dragoncello, finocchio, funghi eduli, guava, indivia, lampone, lattuga, lenticchie, limetta, liquerizia, macis, maggiorana, mais, mango, mela, melanzana, melone cantalupo, melone retato, menta, miele, mostarda, noce moscata, paprica, pastinaca, patata, pepe della Giamaica, pepe nero, peperoncino, pere, pero delle indie, pesche, piccante, pimento, piselli, pomodoro, pompelmo, prezzemolo, prugne, rabarbaro, rafano, rapa, ravanello, ravizzone, rosmarino, rutabaga, salvia, santoreggia, sedano, sesamo, soia, tè, tè di consolida, timo, uva, uva sultanina…

21. FOOD              CHEMICAL AGENT         COMMENTS Alfalfa Sprouts     Canavanine                                  Up to 1.5% of dry weight Alcohol                 ->Acetaldehyde Basil                     Estragole                                     Potent carcinogen and teratogen Beets                    Nitrates                                       Metabolize to nitrosamines. Black Pepper        Piperine, safrole                          Up to 10% by weight Burnt anything                                                          Even lightly browned toast is significant. Celery                   Psoralen                                      Especially when bruised or diseased. Cocoa                   Theobromine                               Causes chromosome damage; also sexual                                                                                    dysfunction in male rats Coffee                   Chlorogenic acid                         Preliminary evidence for association                              and burnt material                           with many organ cancers. Comfrey                Symphytine                                 Quite potent and dangerous. Cottonseed oil       Sterculic acid Mushrooms           Hydrazines                                  Raw worse than cooked. Mustard                Allyl Isothiocyanate                     Causes cancer and chromosome damage                                                                                    in rodents, even at low dosage Potatoes                Solanine                                      Peeling helps. Sprouted eyes are worst. Peanut Butter         Aflatoxin                                     From mold in peanuts and grains. Radishes                Nitrates Rancid and burnt    oxidized lipids                            Important because we consume so much fats and oils Root beer               Safrole                                       Found in large concentrations, but in                                                                                    "Natural" root beer only. Spinach                  nitrates,  oxalic acid                    Especially damaged leaves. Pesticidi naturali: distribuzione ed effetti

22. Ammesso che i pesticidi siano causa di cancro, dovremmo preoccuparci prima di quelli che sono più abbondanti nella dieta, per cui ci dobbiamo porre la domanda: Quanto ne mangiamo ogni giorno di pesticidi naturali e quanto di sintetici? Ogni giorno ingeriamo circa 1,5 g di pesticidi naturali. Altri 2 g di sostanzesempre classificabili come pesticidi sono prodotte durante la cottura dei cibi per un totale di 3,5 g al giorno (e varie migliaia di composti chimici diversi). …e circa 0,09 mg al giorno dei 200 pesticidi sintetici più abbondanti Il 99,99% dei pesticidi che mangiamo sono di origine naturale e solo lo 0,01% è di origine sintetica

23. 1a conclusione: l’esperienza ci suggerisce di non preoccuparci di queste sostanze naturali (se fossero veramente cancerogene saremmo morti da tempo…) 2a conclusione: i dati sulla tossicità ottenuti ad alta concentrazione non vanno estrapolati alle concentrazioni basse a cui siamo esposti Naturale = buono di per sé ? Sintetico = cattivo di per sé ? L’evidenza scientifica non supporta la nozione che i composti sintetici siano intrinsecamente più pericolosi di quelli naturali

24. Un buon caffè… • Contiene oltre 800 sostanze chimiche volatili (prodotte dalla pianta o dai trattamenti). • Ne sono state esaminate 30 nei test cronici • 21 sono risultate cancerogene! • Una tipica tazza di caffè contiene circa 10 mg di pesticidi cancerogeni

25. La tossicità non è lineare! Curva dose-risposta: il concetto più fondamentale usato in tossicologia per la valutazione del rischio e per la regolamentazioneCC La zona della curva più difficile da determinare (ed anche la più importante) è quella alle basse dosi

26. Curve dose-risposta Lineare con effetto soglia Lineare Calabrese e Baldwin (2003) Rumore di fondo Per molte sostanze la curva della tossicità è di tipo a: basse dosi non provocano danno perché vengono eliminate dai sistemi di detossificazione

27. Rumore di fondo Basse dosi sono spesso benefiche Calabrese e Baldwin (2003)

28. Perchè i test ad alta dose non dicono niente sugli effetti alle basse dosi? In altre parole perché vediamo un effetto della dose, non della sostanza? E’ ragionevole: possediamo tutta una serie di difese contro i composti tossici. Enzimi implicati nella detossificazione come Mono-ossigenasi (es. Citocromi P450) e Transferasi (es. Glutatione, Glucosio, ac. Glucuronico…) * I sistemi di detossificazione sono generali: riconoscono gruppi chimici e quindi non possono discriminare tra composti naturali e di sintesi * I sistemi di detossificazione possono non solo detossificare, ma anche attivare numerosi composti (trasformarli in potenti mutageni) * I sistemi di detossificazione sono inducibili ma non possono smaltire oltre un certo livello * Moltissimi cibi sono di introduzione recente (10-100 anni) e quindi non ci possono essere adattamenti biologici significativi nelle popolazioni umane * Se dovessimo riconoscere tutte le sostanze naturali, non basterebbe l’intero genoma a codificare per dei recettori. * Tossine naturali e sintetiche possono agire attraverso gli stessi meccanismi TCDD (diossina) e IC (Indolo Cannabinolo) These results imply that synthetic chemicals, except in the case of high-dose occupational exposure, are unlikely to be responsible for much human cancer. (B.N. Ames)

29. Un esempio classico: DDT A che livello siamo esposti? Raggiungiamo la soglia (risposte di tipo B)? Frequenza dei tumori di ogni sito in topi CF1 trattati con dosi scalari di DDT (EPA 1975).

30. Un esempio recente: Aspartame

32. Control is the sense of biology! In our historical controls over the last 20 years, when we consider groups of 100 or more animals per sex (1934 males and 1945 females), the overall incidence of lymphomas and leukaemias in males is 20.7% (8.0-30.9) and in females 12.4% (7.0-18.4). The overall incidence of malignant brain tumours is 1.7% (0-5.0) in males and 0.7% (0-3.0) in females respectively. Paragonando con i valori medi dei controlli le differenze per le femmine sono minori (sono ancora significative?) Ammettendo che l’effetto sia significativo, sono possibili altre interpretazioni sulla causa dell’aumento di leucemie e linfomi?

33. Sopravvivenza delle femmine nel corso dello studio Fig. 8. Survival in female Sprague-Dawley rats

34. perso mutazione mutazione  oppure    DIVISIONE CELLULARE DIVISIONE CELLULARE 1 2 (a) (b) Interpretazione biologica La somministrazione intorno ai valori della MTD induce morte cellulare in maniera massiccia. Intuizione di Ames: se un composto è mitogenico (induce cioè divisione cellulare) allora probabilmente è un cancerogeno nei roditori, perché i tassi di danno al DNA endogeni (dovuti a fattori intrinseci e sempre presenti) sono ENORMI. Eventi di danno al DNA / cellula / giorno (causate da ossidanti endog.): 105 ratto-104 uomo. E’ difficile immaginare che i cancerogeni aumentino il danno al DNA; è piuttosto plausibile che aumentino la mitogenesi che è MUTAGENICA in vari modi. La mitogenesi (induzione della divisione cellulare) è uno dei maggiori responsabili della moltiplicazione del danno esogeno (o endogeno) al DNA che alla fine porta alle mutazioni. Rappresentazione schematica della via che porta all’inattivazione () di entrambe le copie di un gene recessivo soppressore dei tumori. Le due linee verticali rappresentano una coppia di cromosomi con il gene in questione. La divisione cellulare aumenta la mutagenesi a causa de seguenti processi: addotti al DNA convertiti in mutazioni prima che possano essere riparati (1 e 2a), mutazioni dovute alla replicazione del DNA (1 e 2a); vulnerabilità a danno del DNA in replicazione (1 e 2a); ricombinazione mitotica (2a), conversioni geniche (2a) e non disgiunzioni (2a) sono più frequenti e le prime due danno luogo alla stessa mutazione su entrambi i cromosomi

35. Si guadagna o si perde a scambiare i pesticidi sintetici con quelli naturali? * Le specie selvatiche in genere contengono pesticidi naturali in quantità maggiori rispetto alle corrispondenti specie selvatiche Es. Solanina in Solanum tuberosum e Solanum nigrum * Questo è stato dimostrato anche per varietà di specie coltivate più resistenti Solanina o Chaconina (teratogeni e bloccano trasmissione nervosa) 15 mg/200g (porzione normale) in Solanum tuberosum * Pesticidi sintetici che hanno meccanismi di azione simili vengono ingeriti in quantità molto più basse (Malathion 0.006 mg/giorno) e magari non sono cancerogeni. * Molti pesticidi naturali (e sintetici) possono accumularsi negli organismi (sostanze lipofile)

36. 1) La storia del sedano resistente agli insetti: When a major grower introduced a new variety of highly insect-resistant celery into commerce, a flurry of complaints were made to the Centers for Disease Control from all over the country because people who handled the celery developed rashes and burns when they were subsequently exposed to sunlight. Some detective work found that the pest-resistant celery contained 6,200 ppb of carcinogenic (and mutagenic) psoralens instead of the 800 ppb present in normal celery. It is not known whether other natural pesticides in the celery were increased as well. The celery is still on the market (cit. da Ames). 2) Storia di una nuova varietà di patata: A new potato, developed at a cost of millions of dollars, had to be withdrawn from the market because of its acute toxicity to humans--a consequence of higher levels of two natural toxins, solanine and chaconine. Solanine and chaconine inhibit cholinesterase, thereby blocking nerve transmission, and are known rodent teratogens (cit. da Ames). Necessità dei pesticidi (naturali o sintetici che siano): fate pure la vostra scelta! (rischi per la salute e costi ambientali) 3) Storia di mutazioni spontanee nelle zucchine. Alti livelli di Cucurbitacin E (causate da mutazioni spontanee o da incroci con variatà selvatiche) conferiscono un sapore molto amaro e sgradevole e causano crampi, diarrea e anche collasso.

37. Non solo la natura non è buona di per sè… …ma è stata storicamente la sorgente di un gran numero di veleni, farmaci, principi attivi… Segale contaminata dal fungo Claviceps purpurea

38. Rifiutare questo discernimento comporta rischi? • Ricerca bibliografica (su Medline) usando come parole chiave: “Herbal remedy” oppure “Herbal kidney failure” • Un prodotto di erboristeria cinese ha causato più di cento casi di nefropatia, richiedendo trapianto di reni in diversi casi, e causato alcune decine di casi di tumore (es. uretere) • La causa è probabilmente dovuta all’utilizzo della pianta Aristolochia fangchi invece di Stephania tetrandra. • i rimedi di erboristeria possono essere estremamente pericolosi perché sono meno controllati dei prodotti farmaceutici convenzionali. • Accettare il discernimento basato sulla scienza comporta dei rischi? Sicuramente sì, ma sono in genere decisamente più limitati rispetto a quelli che si corrono in assenza della scienza Greensfelder, L. (2000).  Herbal product linked to cancer. Science, 288: 1946. Kessler, D.A. (2000) Cancer and herbs. The New England Journal of Medicine 342:1742-3 Lee S et al. (2004) Nephrology 9:126-9.

39. CH3COOH Discernimento! (vagliate tutto, trattenete il valore e…) Acido salicilico Acido acetil salicilico (Aspirina) Acido salicilico: indipendentemente gli abitanti del vecchio e nuovo mondo avevano scoperto che la corteccia del salice conteneva un rimedio efficace contro dolori e febbre. Il composto è stato successivamente identificato come l’acido salicilico da Raffaele Piria nel 1838. Nel 1897 Felix Hoffman sintetizza un derivato dell’acido salicilico per acetilazione: nasce l’aspirina, efficace come l’acido salicilico dal punto di vista terapeutico con molti meno effetti collaterali negativi di quest’ultimo (l’acido salicilico è caustico e lievemente tossico, ed è adoperato quasi esclusivamente per applicazioni esterne).

40. Bibliografia • Pubblicazione prof. B. Ames su pesticidi e cancro (Paracelsus to parascience) http://ec.europa.eu/environment/ppps/pdf/ma_reding_annex2.pdf Tutte le pubblicazioni: http://www.bruceames.org/bnapublications.php • 2) Per le curve dose/risposta: Calabrese(2002) (tra “Pubblicazioni scientifiche”) Calabrese EJ, Baldwin LA. (2003) Toxicology rethinks its central belief. Nature 421:691-2 • 3) Autori vari “Tumori e alimentazione” Ulisse edizioni, 1991 • 4) Dolara P. “Tossicologia generale e ambientale”, Piccin 1997 (esempio di scienza che elimina alcuni dati e ne interpreta altri a senso unico) • 5) Morandini “Naturale o transgenico? Criteri per una scelta” (capitolo in BIOTECNOLOGIE: i vantaggi per la salute e per l'ambiente”, Editore XXImo secolo) • 6) EPA DDT A review of scientific and economic aspects of the decision to ban its use as a pesticide. EPA, Washington (1975) Continua…

41. Bibliografia (continua) • 7) Poisonous plants of the Southeastern US • 8) http://www.ramazzini.it/fondazione/docs/AspartameGEO2005.pdf (lavoro pubblicato nel 2005 da ricercatori della fondazione Ramazzini di Bologna e ampiamente pubblicizzato sui media)