Ensayos de restricción y corrimiento electoforético en geles de agarosa

1. Ensayos de restricción y corrimiento electoforético en geles de agarosa Equipo 1

2. Objetivos de ensayos de restricción de plásmidos • Conocer el principio de separación y detección de ácidos nucleicos en geles de agarosa. • Emplear la electroforesis en geles de agarosa para visualizar ácidos nucleicos. • Determinar el tamaño de fragmentos de ácidos nucleicos separados en geles de agarosa. • Conocer la utilidad de las enzimas de restricción en la transformación genética y la biotecnología.

3. Endonucleasas o enzimas de restricción: • Enzimas que restringen la invasión de DNA viral. • Manipulan ácidos nucléicos proteínas recombinantes • Descritos tres tipos (I, II, III)

4. Endonucleasa tipo II • Actividad: restricción • Cofactor: NO MODIFICAN LA SECUENCIA BLANCO Mg2+

5. Endonucleasa tipo II • secuencias palindrómicas • Extremos cohesivos Extremos romos EcoRISmaI Las primeras 3 letras de la enzima se refieren a las iniciales del nombre científico de la bacteria de donde se aisló y se escribe en itálicas. Por ejemplo, EcoRI se refiere a que la enzima proviene de Escherichiacoli.

6. Vector que se uso para introducir el DNA de interés • Sitio múltiple de clonación

7. Endonucleasastipo II a usar en la práctica • NdeI • BamHI

8. Factores que afectan la restricción: • (-) por contaminantes • (+) adición policationes • Plásmido superenrrollado

9. Obtención patrones RFLP Identificación de individuos a partir de muestras de fluidos • Mapa de restricción:

10. Usos de las enzimas de restricción

11. Electroforesis en geles de agarosa. • Método que utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculassegún su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa. • En el caso del DNA que es una molécula grande necesita una malla de gel con poros amplios para poder separarse. • Malla comúnmente usada AGAROSA

12. La agarosa es un polisacárido, cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50°C y formar un gel, semisólido al enfriarse. • Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas, se usa usualmente para separar moléculas grandes de alrededor 20.000 nucleótidos

14. Migración en gel de Agarosa • En soluciones alcalinas, los fosfatos de los nucleótidos se encuentran cargados negativamente, entonces al imponer un campo eléctrico, estas moléculas migran hacia el electrodo positivo o ánodo. • Cuando la migración toma lugar en un gel, las moléculas de DNA se separan de acuerdo a su tamaño, en donde las moléculas pequeñas se mueven más rápidamente a través del poro del gel que las más grandes.

15. Ensayo de restricción Etiquetar dos tubos de microfuga Añadir 10μL de plásmido y 1μL de Tango10X Baño de hielo 100°C/5min 5min 1→ +1μL BamHI o NdeI 2→ +1μL BamHI y NdeI Centrifugar por 5 segundos Mezclar suavemente 37°C 1.5h +0.5 μL Rnasa (1μg/mL) Baño de hielo G’GATCC CCTAG’G 37°C/30min CA’TATG GTAT‘AC

16. Preparación del Gel Colocar bandeja de acrílico y el peine dentro de la cámara. Esperar a que la temp. baje. Añadir 35 mL de TAE 1X, tapar con algodón. Calentar 1 a 3 min. Pesar 0.35g de agarosa Añadir 2µL de Bromuro de etidioo SYBR Green Quitar acrílicos y colocar gel en cámara de electroforesis. Dejar enfriar hasta que polimerice. Depositar el gel en la bandeja, evitando formación de burbujas. La cámara se llena con aprox. 275mL TAE

17. PREPARACIÓN Y CARGADO DE LAS MUESTRAS

18. Centrifugar por 3 segundos en microfuga, para que se mezcle y deposite el líquido en el fondo. • Retirar el peine de la bandeja. Muy importante: los pozos del gel tienen que estar orientados hacia el cátodo, generalmente el electrodo es de color negro. • Tomar el volumen total de cada uno de los tubos de microfuga preparados según la tabla 4.1 y colocar en los pozos como se muestra en la Figura 4.8.

19. Aplicar 80 V por 30 a 40 min. Verificar que las muestras migren hacia el lado positivo de la cámara. • Al concluir la electroforesis desconectar el equipo y retirar la bandeja para la observación de DNA (USAR GUANTES). El gel puede ser inmediatamente colocado sobre una lámpara de luz UV para visualizar las bandas de DNA. • Tomar la foto del gel. • medir la distancia desde el centro del pozo hasta cada una de las bandas de DNA detectadas. • Construir la curva de estándares de peso molecular • Analizar los resultados.