Markery molekularne sprzężone z genami kontrolującymi męską sterylność u żyta z cytoplazmą C .

1. Markery molekularne sprzężone z genami kontrolującymi męską sterylność u żyta z cytoplazmą C.

2. System cms (cytoplazmatyczno-genowa męska niepłodność) N S cytoplazma normalna cytoplazma sterylizująca Rf - allel płodności (restorer) rf - allel sterylności (nonrestorer) N S Rf Rf Rf Rf N S Rf rf Rf rf N S rf rf rf rf

3. Źródła cytoplazmy sterylizującej pręcikowie dostępne w hodowli żyta: • Typ: cms-P (Pampa) • a. cms-Pampa (Geiger i Schnell 1970) • 2. Typ: cms-V (Vavilovii) • a. cms-R (Kobyljanskij 1969) • b. cms-C (Łapiński 1972) • c. cms-G (Adolf i Winkel 1985)

4. Poszukiwania markerów molekularnych sprzężonych z genami kontrolującymi męską sterylność/płodność w cytoplazmie CMS-C BSA - Analiza skrajnych segregantów (Bulk Segregant Analysis) Technika RAPD - 1000 starterów 10 nukleotydowych o losowych sekwencjach Dwie populacje F2 otrzymane z krzyżowań między męskosterylnymi liniami posiadającymi cytoplazmę CMS-C, a liniami przywracającymi płodność

5. [711(cms-C) x DS2]F2 - 513 osobniki 13 osobników męskosterylnych; 19 osobników męskopłodnych 10 markerów różnicujących grupy skrajne [544(cms-C) x Ot0-20]F2 - 526 osobników 13 osobników męskosterylnych; 13 osobników męskopłodnych 7 markerów różnicujących grupy skrajne 3 markery wspólne dla obu mieszańców pr2/450bp, pr319/550bp, pr743/750bp 2 markery generowane przez te same startery, ale dające produkty o nieco innej wielkości: [711(cms-C) x DS2]F2: pr530/800bp - [544(cms-C) x Ot0-20]F2: pr530/850bp [711(cms-C) x DS2]F2: pr670/950bp - [544(cms-C) x Ot0-20]F2: pr670/900bp

6. W celu określenia relacji pomiędzy wykrytymi markerami, a genami kontrolującymi płodność w cytoplazmie cms-C przeprowadzono analizę segregacji markerów w populacjach F2 oraz mapowanie w przedziałach (identyfikacja QTL): Analizowane populacje (populacje mapujące): [711(cms-C) x DS2]F2 - 120 osobników 10 wykrytych markerów utworzyło 2 grupy sprzężeń liczące odpowiednio 8 i 2 markery [544(cms-C) x Ot0-20]F2 - 152 osobniki 7 wykrytych markerów utworzyło 1 grupę sprzężeń. Na podstawie markerów wspólnych dla mapowanych populacji oraz markerów mających swoje odpowiedniki na silnie rozbudowanej mapie genomu żyta utworzonej na bazie mieszańca DS2 x RXL10 przypisano utworzonym grupom sprzężeń lokalizację chromosomową.

7. Grupy sprzężeń markerów RAPD wykazujących związek z genami męskiej sterylności w cytoplazmie cms-C 544(cms-C) x Ot0-20 711(cms-C) x DS2 pr502/750bp pr2/450bp 9.5cM 25.0cM pr777/600bp pr530/800bp 2.5cM pr743/750bp Rfc2(QTL) 16.9cM 11.0cM pr530/850bp Rfc1a(QTL) 8.0cM pr794/800bp pr433/800bp pr2/450bp 3.9cM 6RS? pr743/750bp Rfc1a’(QTL) 18.1cM 6.5cM Rfc1a(QTL) pr23/500bp 4.6cM pr670/900bp pr670/950bp 13.3cM pozycja QTL wskazana w trakcie analizy danych z oceny męskiej płodności 13.2cM Rfc1b(QTL) Podkreślone – markery mające swoje odpowiedniki na mapie genetycznej żyta opracowanej na bazie mieszańca DS2 x RXL10 pr319/550bp pr319/550bp 2.9cM 4RL 4RL pr777/700bp 1.0cM pr334/700bp

8. Dane z mapowania w przedziałach mają charakter orientacyjny i mogą być obarczone błędami wynikającymi z dwóch przyczyn: 1. Rozkład cechy męskiej sterylności/płodności nie ma charakteru rozkładu normalnego (jest bimodalny w obu populacjach użytych do mapowania) 2. Grupy sprzężeń utworzono wyłącznie z markerów dominujących (RAPD), co uniemożliwia precyzyjne wyznaczenie niektórych parametrów QTL Drugie źródło błędu można wyeliminować zastępując populacje F2 użyte do mapowania populacjami RIL (Recombinant Inbred Lines) lub BC1 Weryfikacja charakterystyki QTL na populacji BC1: {544(cms-C) x [544(cms-C) x Ot0-20]}BC1 - 154 osobniki

9. Grupy sprzężeń markerów RAPD wykazujących związek z genami męskiej sterylności w cytoplazmie cms-C 544(cms-C) x [(544(cms-C) x Ot0-20)]Bc1 544(cms-C) x Ot0-20 pr502/750bp pr530/850bp 10.8cM Rfc1a(QTL) 25.0cM pr2/450bp 8.0cM pr743/750bp pr530/850bp 8.0cM pozycja QTL wskazana w trakcie analizy danych z oceny męskiej płodności 16.8cM pr2/450bp 3.9cM pr743/750bp 6.5cM pr23/500bp Rfc1a(QTL) pr23/500bp 4.6cM pr670/900bp Rfc1a(QTL) 19.6cM 13.3cM Rfc1b(QTL) pr319/550bp pr670/900bp 4RL

10. Przedział mapowy Pozycja QTL (cM) LODmax Efekt addytywny VE pr530/850bp-pr2/450bp 8,0 14,50 1,30 48,6% pr23/500bp-pr670/900bp 10,0 16,69 2,90 Tabela. Charakterystyka loci męskiej sterylności zidentyfikowanych w trakcie mapowania w przedziałach na podstawie danych z oceny płodności roślin w populacji BC1.

11. Efektywność działania markerów wykrytych w trakcie analiz BSA niepełna - - w szczególności dla mieszańca [544(cms-C) x Ot0-20]

12. Marker Klasy fenotypowe Ogółem Chi2 b) Męsko-sterylne Częściowo płodne Męsko-płodne 711cmsC x DS2 pr2/450bp 19 2 3 24 17,84** pr670/950bp 26 7 0 33 26,44** Ogółem 45 37 38 120 544cms-C x Ot0-20 pr2/450bp 7 7 19 33 20,11** pr23/500bp 9 8 21 38 28,85** pr670/900bp 8 7 23 38 20,04** Ogółem 9 15 128 152 Tabela. Efektywność symulowanej selekcji przy użyciu wykrytych markerów RAPD. Liczebności roślin w poszczególnych klasach fenotypowych w populacji składającej się z osobników posiadających allel RAPD charakterystyczny dla formy matecznej (męskosterylnej) mieszańca.

13. U mieszańca [544(cms-C) x Ot0-20] w wyniku symulowanej selekcji udział roślin męskopłodnych maleje w stopniu znaczącym, ale wciąż stanowią one ponad połowę wybranych pojedynków. Wniosek: Na skutek oligogenicznej kontroli cechy męskiej sterylności/płodności w cytoplazmie CMS-C metoda BSA okazała się nie w pełni skuteczna - pozwoliła jedynie na wykrycie markerów sprzężonych z genem o najsilnieszym efekcie fenotypowym. Podjęta została próba wykrycia pozostałych genów kontrolujących cechę na drodze mapowania genomu żyta.

14. Populacja mapująca: [544(cms-C) x Ot0-20]F2 Aktualnie mapa składa się z 82 markerów, w tym: 74 RAPD (przebadano 1200 starterów) 6 ISSR (przebadano 50 starterów) 3 SCAR (przebadano 8 par starterów opracowanych przez Stracke i in. 2003) 11 grup sprzężeń Łączna długość: ok. 525 cM, co stanowi w przybliżeniu 40% genomu żyta

15. pr131/400pz pr1256/1000bp pr926/550pz pr419/650bp pr358/1100bp pr803/550+600pz pr1067/900pz pr1169/600pz pr1224/600bp pr1059/200pz pr1194/700bp pr853/900pz pr651/650pz pr1173/600bp pr1062/1100bp pr677/800pz pr1139/800bp pr139/700bp pr1060/1000bp is11/750bp pr825/700pz pr1260/700bp 5RS (27,2cM) pr1146/600bp pr1000/750bp is3/650pz pr1140/600bp Gr.C (27,8cM) pr732/530bp pr1187/500bp pr502/750pz pr980/650pz pr1000/700bp pr1194/1000bp is14/650pz pr1133/350pz pr360/390bp is18/640bp pr1193/400bp pr124/650bp pr605/870pz is2/1200pz Gr.B (49,3cM) pr1174/1000bp pr372/200pz pr1182/1000bp pr71/700pz pr1148/500pz pr1251/800bp pr1117/700bp Gr.A (59,3cM) pr728/950pz 2R (66,1cM) pr1196/600pz pr1111/900pz pr530/350pz pr1166/1000bp pr1255/600pz pr530/850pz pr478/280bp pr358/290bp pr369/1050bp pr1185/800bp pr743/750pz pr1187/400bp pr224/850pz pr2/450pz pr435/390bp pr1140/400bp pr1223/600bp pr582/850pz pr273/650bp pr23/500pz pr1225/1000bp pr1260/500bp pr1174/800bp 7R (45,1cM) SPC14M55 pr1260/800bp pr1059/600pz pr1218/600bp pr1039/700bp pr670/900pz Gr.F (0,9cM) is19/900bp Gr.D (11,9cM) Gr.E (22,2cM) pr1139/800bp pr429/950bp pr319/550pz 1R (107,6cM) 4R (109,2cM) Podkreślone – markery mające odpowiedniki (APR) na mapie mieszańca DS2 x RXL10

16. pr131/400pz pr1256/1000bp pr926/550pz pr419/650bp pr358/1100bp pr803/550+600pz pr1067/900pz pr1169/600pz pr1224/600bp pr1059/200pz pr1194/700bp pr853/900pz pr651/650pz pr1173/600bp pr1062/1100bp pr677/800pz pr1139/800bp pr139/700bp pr1060/1000bp is11/750bp pr825/700pz pr1260/700bp 5RS (27,2cM) pr1146/600bp pr1000/750bp is3/650pz pr1140/600bp Gr.C (27,8cM) pr732/530bp pr1187/500bp pr502/750pz pr980/650pz pr1000/700bp pr1194/1000bp is14/650pz pr1133/350pz pr360/390bp is18/640bp pr1193/400bp pr124/650bp pr605/870pz is2/1200pz Gr.B (49,3cM) pr1174/1000bp pr372/200pz pr1182/1000bp pr71/700pz pr1148/500pz pr1251/800bp pr1117/700bp Gr.A (59,3cM) pr728/950pz 2R (66,1cM) pr1196/600pz pr1111/900pz pr530/350pz pr1166/1000bp pr1255/600pz pr530/850pz pr478/280bp pr358/290bp pr369/1050bp pr1185/800bp pr743/750pz pr1187/400bp pr224/850pz pr2/450pz pr435/390bp pr1140/400bp pr1223/600bp pr582/850pz pr273/650bp pr23/500pz pr1225/1000bp pr1260/500bp pr1174/800bp 7R (45,1cM) SPC14M55 pr1260/800bp pr1059/600pz pr1218/600bp pr1039/700bp pr670/900pz Gr.F (0,9cM) is19/900bp Gr.D (11,9cM) Gr.E (22,2cM) pr1139/800bp pr429/950bp pr319/550pz 1R (107,6cM) 4R (109,2cM) Podkreślone – markery mające odpowiedniki (APR) na mapie mieszańca DS2 x RXL10 Prawdopodobna pozycja QTL wskazana w trakcie analizy danych z oceny męskiej płodności

17. Przypuszczalne bliskie sąsiedztwo markerów SCAR opracowanych w Hohenheim dla genów kontrolujących męską sterylność w cytoplazmie Pampa oraz markerów opracowanych w AR Szczecin dla CMS-C (źródło z grupy CMS-V), daje szanse na to, że opracowane zestawy markerów mogą się okazać przydatne przy pracach hodowlanych z obiema tymi cytoplazmami Ryc. Wyniki wstępnego mapowania markerów opracowanych w Hohenheim na mapie sprzężeń markerów RAPD zlokalizowanych na chromosomie 4RL

18. W Akademii Rolniczej w Szczecinie trwają prace zmierzające do przekształcenia markerów RAPD zmapowanych na chromosomie 4RL (w sąsiedztwie locus Rfc) w markery typu SCAR. Aktualnie przekształcono trzy markery: pr2/450bp – SCSz2L450 pr23/500bp – SCSz23L500 pr334/700bp – SCSz334L700 pr670/900bp – SCSz670L900

19. SCSz2L450 (linie wsobne żyta) SCSz23L500 (linie wsobne żyta) SCSz334L700 (linie wsobne żyta)

20. SCSz670L900(F2)

21. Zapewnienie satysfakcjonującego poziomu selekcji genotypów męskosterylnych w cytoplazmie CMS-V wymaga opracowania markerów dla pozostałych loci Rf, zlokalizowanych prawdopodobnie na chromosomach 3R i 6R.