Le tecniche di coltura in vitro

1. Le tecniche di coltura in vitro Francesco Sunseri

2. La definizione “… the aseptic culture of plant protoplasts, cells, tissues or organs under conditions which lead to cell multiplication or regeneration of organs or whole plants “ (Murashige, 1963)

3. Argomenti da trattare: • Concetti fondamentali / Storia • Tipi di cellule o tessuti • Processi di crescita • Regolatori di crescita

4. Che cosa sono • La coltura di cellule e tessuti di piante trova il suo fondamento nella totipotenza cellulare • In tutte le piante vascolari l’embrione si evolve in una struttura bipolare per la presenza di due meristemi apicali • Durante il ciclo della pianta tali meristemi producono continuamente nuovi organi che si aggiungono a quelli prodotti durante l’embriogenesi

5. Che cosa sono • Le piante vascolari sono state pertanto definite organismi a ontogenesi ricorrente, a causa di tale fenomeno nelle piante non si assiste alla separazione tra linea somatica e linea germinale • Durante lo sviluppo gli apici vegetativi possono modificarsi in apici riproduttivi, sviluppando le strutture tipiche della riproduzione • Per entrambe queste ragioni nelle piante vascolari qualsiasi cellula somatica può considerarsi un progenitore potenziale di un nuovo individuo …

6. Coltura in vitro • Il termine sottende a differenti metodologie che consentono la crescita e lo sviluppo di cellule, tessuti ed organi vegetali su terreni sintetici • La crescita e la moltiplicazione di nuove cellule si può indurre anche da tessuti già differenziati che subiscono un processo di sdifferenziamento • Si formano quindi ammassi amorfi, definiti calli, che possono essere mantenuti indefinitamente in vitro o possono essere indotti a rigenerare organi o piante intere

7. Callo • Rappresenta la naturale risposta della pianta ad una ferita • E’ una massa di cellule in attiva divisione per la produzione di cellule indifferenziate prodotte da espianti di tessuto vegetale • E’ formato da cellule totipotenti

8. Coltura in vitro • Tutti i vegetali possono essere considerati sorgenti potenziali di cellule per coltura in vitro • Alcune specie sembrano fare eccezione a tale regola, ma è probabile una erronea scelta delle condizioni colturali • Infatti le condizioni colturali possono mostrare differenze significative in relazione a sostanze specifiche e condizioni microambientali utilizzati

9. Principali caratteristiche Si effettuano: • su micro scala • in condizioni ambientali ottimizzate (nutrienti, luce, temperatura) • in assenza di microrganismi (funghi, batteri, virus).

10. 1. Storia • Teoria cellulare e totipotenza • Formazione del callo e sostanze di crescita • Prime colture cellulari • Prime colture di tessuti vegetali • Colture di organi vegetali

11. Teoria cellulare …. Le cellule furono osservate per la prima volta nel 1664 da Robert Hooke, che studiò con un microscopio rudimentale sottili fettine di sughero e vide che esse erano formate da elementi di forma regolare. Egli chiamò cellule questi elementi (dal latino cellula, "piccola stanza"), perché esse avevano l'aspetto di piccole scatole. Cork tissue as observed by Robert Hooke in 1664

12. Le prime colture cellulari…. …Haberlandt .. agli inizi del 1900 … propose il concetto di totipotenza … cellule allevate in adatte conditizioni Callo coltivato a partire dal cambio (Gautheret, Nobecourt, Whire nel 1930) … le cellule restavano vive ma non si moltiplicavano

13. Le prime colture di tessuti …. - in funzione della scoperta dei “Regolatori di crescita” • Distensione cellulare…ruolo delle auxine • Divisione cellulare ... ruolo delle citochinine • Rigenerazione di tabacco ....(Skoog and Miller) …. interazione tra auxine e citochinine dava differenziazione.

14. Successivi sviluppi … • GA per la crescita dei germogli • Aux + Cyt + zucchero > sviluppo vascolare • Colture di ‘strati sottili’ … interazione con altri fattori es. pH

15. Il primo uso commerciale di piante propagate su mezzo artificiale è stato fatto per la germinazione e lo sviluppo di orchidee nel 1920

16. Pianta di carota da cellule radicali – Stewart in 1964

17. Pianta di tabacco da singola cellula – Vasil & Hilderbrandt 1965

18. Coltura di organi vegetali ….… ma la coltura delle piante in vitro ha visto il suo pieno sviluppo grazie alla messa a punto di un mezzo di coltura artificiale da parte di Murashige & Skoog nel 1962  micropropagazione

19. 2. Tipi di cellule e tessuti • Molti tipi di cellule • Grado di specializzazione diversificato - Meristematico - Embrionale - Riproduttivo

20. Tessuti meristematici ... • Germoglio ... apicale, … ascellare

21. new leaf tunica corpus cortex pith apical meristem leaf trace axillary meristem procambium

22. Tessuti meristematici ... • Germogli ... apicali, … ascellari • Foglie • Radici

23. Tessuti embrionali ... • Piante pre-formate • Germinali / somatici • Giovanile

24. Tessuti riproduttivi ... • Diploide / Aploide • Femminile / Maschile

25. 3. Processi di crescita • Moltiplicazione • Dominanza apicale • Differenziazione • Crescita • Divisione cellulare • Distensione cellulare • Fasi di sviluppo • Giovanilità • Dormienza

26. 3. Altri processi • Fotosintesi • Traspirazione e assorbimento dell’acqua • Instabilità citologica • Meccanismi fisiologici • Manipolazioni fisiche • Ambiente • Genotipo

27. 4. Regolatori di crescita • Le auxine • Le citochinine • Le gibberelline (GA) • L’acido abscissico (ABA) • L’etilene

28. Regolatori di crescita • Essenziali (non sono noti effetti mutageni) • Il solo composto naturale è lo IAA (Indole-3-Acetic Acid). Altri prodotti sintetici sono NAA, IBA, 2,4-D, 2,4,5-T, Pichloram) – meno costosi e più stabili • Stimolazione della distensione cellulare in fusti e coleoptili • Promuovono la radicazione • Sono sintetizzate nei meristemi, specialmente in quelli apicali (inibizione della crescita delle gemme laterali) Auxine

29. Regolatori di crescita Citochinine • Essenziali (non sono noti effetti mutageni) • Un solo composto naturale la Zeatina; analoghi sintetici sono: Benzyladenine (BA) e Kinetin • Stimola la divisione cellulare • Promuove la formazione di gemme avventizie • Sono sintetizzate nel meristema radicale e trasportate nel floema sotto forma di Zeatin-riboside

30. Regolatori di crescita Gibberelline • Questa classe comprende più di 70 composti, varie forme dell’ acido gibberellico • In commercio sono disponibili diversi formulati (GA3, GA4, GA9) • Stimola l’eziolatura dello stelo • Sintetizzate nelle giovani foglie

31. Regolatori di crescita Acido abscissico (ABA) • Esiste solo un componente naturale • Promuove l’abscissione delle foglie e la dormienza dei semi • Gioca un ruolo dominante nella chiusura degli stomi in condizioni di stress idrico • Ha un ruolo importante nell’embriogenesi (aiuta la formazione di embrioni normali)

32. Bilancio ormonale AuxineCitochinine Alte Basse Basse Alte • Formazione di radici dopo il taglio • Embriogenesi • Formazione di radici avventizie • Induzione a callo • Formazione di germogli avventizi • Crescita di germogli ascellari

33. Rapporto auxine : citochinine

34. Azione dell’ormone per ….. • Applicazione + assorbimento • Endogeno + applicato • Accumulazione e assuefazione • Interazione / Sequenza di applicazione • Impulso o esposizione prolungata

35. Mezzo di coltura in vitro • Elementi minerali (17 elementi essenziali) • Fonte d’energia e di carbonio (saccarosio) • Regolatori di crescita (fitormoni) • Vitamine • Composti organici • Acqua • pH (5.0-5.7) • Gelling agents: Agar, agarose, gellan gum

36. Composti inorganici • Macroelementi (>mg/l di N, P, K, Ca, Mg e S) e microelementi (<mg/l Fe, Cu, Mn, Co, Mo, B, I, Zn, Cl e alcune volte Al, Ni e Si). • Disponibili formulazioni commerciali in polvere • Murashige and Skoog Medium (1965) è il mezzo di coltura più comune • Il mezzo Gamborgs B5 è più diffusamente utilizzato per colture cellulari in sospensione.

37. Vitamine • Un ampio range di vitamine sono disponibili e possono essere usate • Generalmente, più è piccolo l’espianto, più appropriata deve essere la scelta della/e vitamine • Un cocktail di vitamine è spesso usato • L’inositolo di solito deve essere aggiunto a maggiori concentrazioni (100mg/l)

38. Vitamine • Tiamina • Piridossina • Acido nicotinico • Biotina • Acido Citrico • Acido Ascorbico • Myo-inositolo

39. La rigenerazione può avvenire • via organogenesi • via embriogenesi somatica

40. Organogenesi • L’organogenesi prevede la formazione di germogli, foglie e radici e si verifica quando si differenziano in vitro centri meristematici unipolari quali le gemme avventizie • Questi organi possono derivare da meristemi preesistenti o da cellule indifferenziate • Come per l’embriogenesi può aversi una fase intermedia di callo, ma spesso si osserva senza il passaggio da questo stadio

41. Organogenesi La differenziazione di radici e germogli in colture di tessuto di tabacco era funzione del rapporto auxine-citochinine, e la differenziazione dell’organo potrebbe essere regolato dal cambiamento delle concentrazioni relative delle due sostanze nel mezzo di coltura 1957 Skoog and Miller

42. Embriogenesi Somatica • L’embriogenesi somatica consiste nella produzione di embrioni da cellule somatiche o non germinanti, la rigenerazione comporta la successione delle fondamentali fasi di sviluppo che caratterizzano la differenziazione dell’embrione zigotico • Si assiste quindi alla comparsa di una struttura bipolare, priva di connessioni vascolari con il tessuto originario, che evolve in un embrione cotiledonare

43. Acclimatamento • Le piante ottenute in vitro devono essere preparate alla sopravvivenza in vivo • Alta umidità • Luce • Temperature tra 20-25°C • Elementi nutritivi • Terreno adatto

45. Applicazioni delle colture in vitro • micropropagazione e rapida moltiplicazione di cloni • rigenerazione e trasformazione genetica • induzione di variazione somaclonale • ottenimento di aploidi da micro e macrospore • allevamento e mantenimento di piante virus esenti • manipolazione di protoplasti ed ibridazione somatica • conservazione del germoplasma • produzione di metaboliti di interesse industriale

46. Plant GeneticTransformation

47. Overview • Introduzione • Plant genetic transformation • Stato attuale delle PGM • Trends futuri e problemi

48. Introduzione • Potenzialità delle biotecnologie vegetali • Uso di nuovi geni introdotti • Tratti che i plant breeders vorrebbero trasferire

49. Alta produttività Alta qualità nutrizionale Adattabilità all’inter-cropping Fissazione dell’azoto Resistenza a stress idrico Resistenza a stress biotici Adattabilità alla meccanizzazione Insensibilità al fotoperiodo Eliminazione di composti tossici Tratti genetici di interesse per i plant breeders

50. Sviluppo dei cibi GM Prima rigenerazione di piante intere da in vitro culture 1950 1973 La ricerca sviluppa capacità ad isolare geni 1^ pianta transgenica : tabacco resistente ad antibiotico 1983 PGM resistenti a insetti, virus e batteri sono saggiate in campo per la prima volta – TRATTI UTILI 1985 Primo campo di cotone GM condotto con successo 1990 Pomodoro Flavr-Savr – 1^ FDA approvazione per un cibo 1994 Soia Roundup della Monsanto approvata per il commercio negli Stati Uniti 1995