Uso da b i o i nformática na análise genômica

1. Uso da bioinformática na análise genômica

2. ATCTCGTAGCT ATCTCGTAGCTA ATCTCGTAGCT ATCTCGTAGCTAG ATCTCGTAGCT ATCTCGTAGCTAGC ATCTCGTAGCT ATCTCGTAGCTAGCT ATCTCGTAGCT ATCTCGTAGCTAGCTA ATCTCGTAGCT ATCTCGTAGCTAGCTAC ATCTCGTAGCT ATCTCGTAGCTAGCTACG ATCTCGTAGCT ATCTCGTAGCTAGCTACGA ATCTCGTAGCT ATCTCGTAGCTAGCTACGAC ATCTCGTAGCT ATCTCGTAGCTAGCTACGACG ATCTCGTAGCT ATCTCGTAGCTAGCTACGACGT ATCTCGTAGCT ATCTCGTAGCTAGCTACGACGTC ATCTCGTAGCT ATCTCGTAGCTAGCTACGACGTCT ATCTCGTAGCT ATCTCGTAGCTAGCTACGACGTCTA A G C T A C G A C G T C T A TAGAGCATCGATCGATGCTGCAGATGATGCTAGCATCGGCTAGGCGACG

3. Start End

4. 30 20 10 Processamento de seqüências cromatograma acgatctcgctagctgctactgtagccgcgattattcgcgatctacgtatatcgcgatcgatc • O programa Phred lê o cromatograma e nomeia as bases • Cada base tem uma chance de erro de sua nomeação (10% = 0,1) • A escala de Phred é semelhante à de pH multiplicado por 10: • - chance de erro de 0,001 = 10-3 = Phred 30 • A nomeação é praticamente aleatória no início e no final, onde a chance de erro é alta (baixo valor de Phred)

5. T C A G BIOINFORMÁTICA UFMG LCC-CENAPAD In the Pursuit of Optimal Sequence Trimming Parameters for EST Projects Fabiano C. Peixoto & J. Miguel Ortega

6. 50 40 30 20 10 0 • Noticed: • BLAST results • Phred 15 • Too much trimming

7. .TGAAGCTTTCAGCTTCTTTAGGAGGATCGTTTTTAGAATCCCCTGCAAC GTTACCACGGTGGATTTCACTGACTGCGACGTTCTTAACGTTGAATCCAA CGttGCTACCAgggagagcctcagtaagtgcttcatgatgcatttcgaca gaattgacttcagtcgacaaaccttgcggagcaaaagtgacgaccatacc aggcttgatgataccagtttcaacgcctcggggccaggctggcgtgaaca gggcctagcgggtccgcgggggaagggtcccggctcaatccaccaataga gcggagctaaagtgacgggggcgcca Phred 15 Query: 469 TTAGGAGGATCGTTTTTAGAATCCCCTGCAACGTTACCACGGTGGATTTCACTGACTGCG 528 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct: 1038 ttaggaggatcgtttttagaatcccctgcaacgttaccacggtggatttcactgactgcg 979 Query: 529 ACGTTCTTAACGTTGAATCCAACGTTGCTACCAgggagagcctcagtaagtgcttcatga 588 ||||||||||||||||| || |||||||||||||||||| |||||||||||||||||||| Sbjct: 978 acgttcttaacgttgaagcccacgttgctaccagggagaccctcagtaagtgcttcatga 919 Query: 589 tgcatttcgacagaattgacttcagtcgacaaaccttgcggagcaaaagtgacgaccata 648 |||||||||||||| |||||||||| |||| ||||||||||| ||||||||||||||||| Sbjct: 918 tgcatttcgacagacttgacttcagccgaccaaccttgcggaccaaaagtgacgaccata 859 Query: 649 ccaggcttgatgataccagtttcaacgc 676 |||||||||||||||||||||||||||| Sbjct: 858 ccaggcttgatgataccagtttcaacgc 831

8. Sequences: • pUC18 plasmidial vector (published sequence) • Sequence reaction: • Single pool - 3 plates (96 samples) • MegaBACE sequencer • 3 reads for each plate, esd processing - 846 reads • Processing: • BLAST (MegaBLAST, as in UniGene) • Phred • trim: a chromatogram analyzer • trim_alt: trim_cutoff parameter 1% up to 25% Experimental approach

9. Phred

10. 16% 17% Additional bases Trim_alt sequence BLAST gaps/missmatches (% of bases) 3%

11. Crescimento do GenBank Seqüências 16.000.000 15 milhões 14.000.000 24h 12.000.000 10.000.000 Europeu Japonês 8.000.000 6.000.000 4.000.000 2.000.000 606 0 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 Ano

12. Seqüencias do DNA (genoma) Seqüências do mRNA (genes expressos) • Repetição calculada • draft = 5x • finished = 10x Amostragem tecidos momentos Genoma pequeno (seqüenciador grande) Eucariotos mRNA TR cDNA

13. Seqüenciamento parcial de transcritos

14. Seqüênciamento de genes expressos: Documentar a existência de transcritos gênicos num transcriptoma[otorrin... e ...damonh...] • EST (Etiqueta de Seqüência Expressa) • seqüenciamento único de cada cDNA • extremidades 5’ ou 3’ • ORESTES (ESTs ricas em ORFs) • seqüenciamento único do amplicon derivado de cDNA por PCR inespecífico • prevalece o centro do cDNA (cds)

15. Um mRNA & suas ESTs (A)200 (A)200 mRNA cDNA (fita +) ATG AUG (A)18 ATCATGACTTACGGGCGCGCGAT AAATTTATTATCC (T)18 5’EST cDNA (fita -) 3’EST mRNA cDNA (fita +) AUG (A)18 GGCGCGCGATATCC AAATTTATTATCCATCTACG (T)18 5’EST cDNA (fita -) 3’EST

16. PCR inespecífico & seu ORESTES (A)200 amplicon (fita +) amplicon (fita -) PCR (60ºC) Iniciador (60ºC 37ºC) +ORESTES (outros iniciadores) mRNA amplicon (fita +) AUG GGGCGCGCGATATCGAAAAATTTATAAGGCTAG CCCCGGCGGCTCGGCCGGGGAGATCGATCATGAC AGATCGATCATGACTTACGGGCGCGCGATATCG ORESTES cDNA (fita -)

17. 250 200 150 100

18. O formato FASTA, o mais simples, é anotado >Gene5 EST com homologia... ACTATTACGGCGTAGCTGTAGCTACGTAGCTAGCTGATGCTGACTGATCGTAGCTAGCTGACTGATCGTACGTAGTGTTTTTTTACGTGCGTATTtCTagCTaGtc Seqüências > 50 nt, sem ambiguidades e com anotação, ganham entrada no Entrez Protein/Nucleotide

19. O mundo

20. Alinhador local • Identifica, numa coleção de seqüências, as que apresentam alinhamento com a sua. • Fragmenta sua seqüência e procura homologia no banco de dados. • Descarta todas as pesquisas com pontuação pequena (score baixo) e vai alinhando a vizinhança das com pontuação boa, até chegar ao máximo valor. • É fácil verificar que algumas regiões de certos genes alinham bem, mas outras pouco conservadas, não. O Alinhador Local não quer chegar ao alinhamento final, ele só quer identificar sequências com um nível de homologia significativo

21. Alinhamento local • O fundamento teórico é que a função gênica está quase sempre confinada em domínios contínuos de uma proteína • Se não fosse assim, não teria sentido usar...

22. Programas BLAST & Bancos • Há vários Programas BLAST úteis • Alguns são usados quando a sua sequência é de nucleotídeos (BLASTn, BLASTx e tBLASTx) • Outros são usados quando a sua seqüência é de aminoácidos (BLASTp) • E vários bancos de dados para escolher (nr, pdb, dbEST, yeast, month, etc...) • Ou usa-se limites [organism]

23. BLASTn e BLASTx • A EST identifica o gene homólogo: BLASTn • A EST identifica proteína ortóloga de outro organismo - a evolução conservou a proteína enquanto o DNA divergiu: BLASTx • BLASTx: a EST traduzida em seis proteínas • 1 existe, 5 não... • O mundo Blast é assim

24. tBLASTx • tBLASTx traduz sua seqüência de nucleotídeos para proteína nas 6 possibilidades, exatamente como BLASTx • Depois pesquisa com essas 6 proteínas deduzidas, um banco de dados de nucleotídeos também traduzido dessa maneira • Pra que serve? Pois imagine que a telomerase de Euplotes seja parecida com a telomerase humana, mas os dois DNA não! • Traduzindo a seqüência pesquisada e o banco de dados dbEST foi possível encontrar seqüências da telomerase humana

25. Aglomerados ou Clusters • Uma das atividades em bioinformática é formar aglomerados de todas as sequências geradas no projeto (as figurinhas de um álbum) • Podemos saber quantas vezes um gene foi seqüenciado, e detectar os freqüentes! • E quantos dos genes foram detectados • Usa-se também para validar bibliotecas

26. Programas para aglomerar • Icatools • Phrap • Cap3, Cap4 • Swat • BLAST • MegaBLAST Um aglomerado = Um gene

27. Qualidade das bibliotecas(100 primeiras ESTs) Boa biblioteca ? Número de seqüências 1 2 3 4 5 7 9 11 Freqüência em que uma EST foi amostrada

28. UniGene • Organização das sequências do GenBank em um conjunto de aglomerados • Cada aglomerado do UniGene contém as sequências que representam um gene único • E também informações relacionadas, como em que tecidos o gene é expresso, etc. • E também onde está mapeado

29. MegaBLAST gera o UniGene Todas ESTs contra todas Detecção de homologia > 96% de identidade > 70% do potencial Aglomerar