Catalase-Peroxidase Active Site Restructuring by a Distant and “Inactive” Domain

Catalase-Peroxidase Active Site Restructuring by a Distant and “Inactive” Domain Ruletha D. Baker, Carma O. Cook, and Douglas C. Goodwin Oleh : Tina Dewi Rosahdi (20506001) Rina Budi Satiyarti (20506005)

-Termasuk golongan enzim oksido reduktase-Dibentuk dari dua domain peroksidase, yaitu domain N-terminal (KatGN) dan domain C-terminal (KatGC) -Mempunyai satu sisi aktif multifungsional yang memfasilitasi aktivitas katalase dan peroksidase-Berperan dalam degradasi hidrogen peroksida (H2O2) Katalase-Peroksidase (KatG)

Siklus Katalitik • Aktivitas katalase melibatkan siklus di antara resting dan pembentukan senyawa I • Aktivitas peroksidase mencakup reaksi yang melibatkan pembentukan senyawa I dan senyawa II

Kemampuan Bifungsional Katalase-Peroksidase • Enzim Heme dengan aktivitas katalase besar menunjukkan sedikit aktivitas katalase peroksidase, demikian juga sebaliknya. • Struktural yang sama dari kedua enzim menyediakan sistem yang kuat untuk memisahkan gangguan kecil sisi aktif enzim heme yang berperan penting dalam perbedaan mekanisme dan fungsi.

Domain N-terminal (KatGN) • Mengandung heme terikat • Sisi aktif bifungsional Domain C-terminal (KatGC) • Mengandung 300 asam amino • Tidak mengikat heme • Tidak mempunyai aktivitas katalitik • Jika tidak ada, sisi aktif distal histidin bertindak sebagai • ligan pada heme iron  menyebabkan kemampuan • sisi aktif histidin sebagai basa terganggu

METODE • Ekspresi dan pemurnian wtKatG (tipe alami KatG) • Ekspresi dan pemurnian Domain KatG, KatGN, dan KatGC • Pencampuran dan inkubasi domain • Uji aktivitas katalase dan peroksidase • Spektroskopi Ultra Violet dan sinar tampak (UV-Vis) • Circular Dichroism Spectropolarimetry • Spektroskopi Resonansi Paramagnetik Elektron

HASILFar-UVCircular Dichroism Spectra a = KatGN b = KatGC c = wtKatG d = campuran equimolar abcKatGN dan KatGC

Dari hasil CD Spectra diperoleh : • Persiapan pemisahan domain, KatGN dan KatGC, tidak dihasilkan pada gangguan mayor untuk isi struktur sekunder yang diharapkan untuk masing-masing domain dari enzim tipe alami • Campuran fisika KatGN dan KatGC tidak dengan jelas merubah isi struktur sekunder setiap protein

Reaktivasi KatGN dengan adanya KatGC a. Aktivitas Katalase b. Aktivitas Peroksidase a = campuran equimolar KatGN dan KatGC b = KatGN c = KatGC d = campuran equimolar KatGN dan bovine serum albumin

Aktivasi Katalase dan Peroksidase berdasarkan Waktu Inkubasi pada Campuran Equimolar KatGN dan KatGC • Kreact aktivasi Katalase = 3,4x10-3 min-1 • Kreact aktivasi Peroksidase = 2,5x10-3 min-1

Pengaruh pH pada kreact dan Amplitudo KatGNyang Direaktivasi oleh KatGC • kreact maksimum diperoleh pada pH 6, yaitu 9,4x10-3 min-1 • Substitusi ke persamaan 1) untuk pH 8-6 menghasilkan pKa = 6,2 dan prediksi kreact maksimum = 1,4x10-2 min-1

Pengaruh Ekspresi dan Isolasi KatGCpada Spektrum Absorpsi Sinar Tampak EPR KatGN • Solid line = KatGN • Dashed line = campuran equimolar KatGN dan KatGC • Bold line = campuran equimolar • KatGN dan KatGC (diinkubasi selama 48 jam pada 4oC) • Dotted line = wtKatG

Pengaruh Ekspresi dan Isolasi KatGCpada Spektrum EPR KatGN KatGN KatGC + KatGN (Penambahan equimolar) KatGC + KatGN (Inkubasi selama 48 jam pada T=4oC) Tipe alami KatG

Interfaces di antara domain N-terminal dan domain C-terminal KatG Intrasubunit domain C-terminal Intersubunit domain C-terminal domain N-terminal Heme Distal histidin

Kesimpulan • Pentingnya domain C-terminal pada struktur katalase-peroksidase dan katalisis ditunjukkan oleh kemampuannya untuk mengembalikan domain N-terminal pada konformasi aktif bifungsionalnya. • Domain C-terminal mengatur folding dan pemeliharaan sisi aktif bifungsional.

Terima Kasih

Catalase-Peroxidase Active Site Restructuring by a Distant and “Inactive” Domain