Avaliação da diversidade microbiana

1. Avaliação da diversidade microbiana Amostragem, processamento e detecção Técnicas tradicionais

2. Dificuldades na avaliação (aula anterior): • Falta de recursos humanos capacitados • Amplitude da diversidade • Erosão da diversidade • Falta de metodologias • Porquê avaliar? • Assegurar que microrganismos desempenhem processos necessários a produtividade e sustentabilidade. • Assegurar que pelo menos alguns microrganismos sejam tolerantes a estresses.

3. Etapas da avaliação •  Amostragem • Processamento • Detecção e avaliação: • - Técnicas Fenotípicas • - Técnicas Imunológicas • - Técnicas Moleculares

4. Amostragem • Etapa crítica • São usados equipamentos especializados • Devem ser considerados os seguintes fatores: • - Representatividade • - Não alterar os números e as atividades • - Evitar a introdução de contaminantes • - Estocar em condições adequadas

5. Como minimizar o problema da representatividade • Utilizar amostras compostas em ambientes com distribuição heterogênea • Determinar o número mínimo de amostras: • Os limites de confiança e extrapolações devem ser determinadas estatisticamente.

6. Estratégias de amostragem O Ar é um meio restritivo para os microrganismos (*) Acesso - direto Amostragem no Número de microrganismos - Baixo Ar Equipamentos Processamento(acoplado) - Concentração em filtros (*) Apesar de restritivo transmite inúmeros agentes patogênicos

7. Os microrganismos alcançam o ar através dos aerossóis Depende do tipo de microrganismo, partículas e fase gasosa

8. Diferente de outros ambientes, no ar os microrganismos não se multiplicam Morte dos microrganismos no ar: dN/dt= -k.N ou ln(N/No) = -k.t k - coeficiente de inativação (velocidade específica de morte) Depende do tipo de microrganismo e das condições ambientais Fatores ambientais: Umidade relativa Temperatura Radiação (pigmentação, reparo do DNA) Radicais de O2 Íons

9. Amostragem do ar 1. Impacto - deposição em superfícies sólidas. Ex: coletor de Andersen 2. Simulação respiratória (tamanho partícula 0,8 – 15 μm; velocidade do ar) 3. Colisão - Captura em líquido. Ex: AG-30 4. Centrifugação 5. Filtração 6. Deposição - Coleta passiva

10. Amostrador de Andersen

12. Simulação respiratória

13. Placas após incubação Ágar Dextrose Ágar Sangue

14. Impacto em líquido: AG-30

15. Equipamentos para amostragem do ar: Amostragem passiva Apenas microrganismos que caem nas placas Amostragem ativa Recuperação forçada usando um volume determinado

16. Método usado nas estações espaciais(Dados NASA)

17. Importância Aeromicrobiologia extramuro: Dispersão de patógenos e toxinas (botulínica, estafilocócica, LPS) Fitopatógenos (ferrugem) Doenças pulmonares e gastro-intestinais de animais Despejo de resíduos (sólidos e líquidos) Guerra biológica Aeromicrobiologia intramuro: Edifícios (doenças dos Legionários-Legionella pneumophila, bactéria aquática disseminada pelos aparelhos de ar condicionado e água potável) Viagens de avião Saúde pública - gripes

18. Depende do nível de matéria orgânica Acesso - Direto ou remoto Amostragem na Números - elevados ou baixos água Equipamentos -Recipientes, filtros, ROV Processamento - diluição ou concentração

19. ROV(Veículo operado de forma remota) usados nas águas hidrotermais (Yellowstone Park) Águas termais são difíceis de amostrar convencionalmente Equipamentos Robô controlado remotamente abre o recipiente no local de amostragem para não ocorrer contaminação com microrganismos de outras profundidades.

20. Amostragem em Acesso - Remoto Número de microrganismos - elevado Sedimentos Equipamentos - observatórios, sondas Processamento - diluição

21. Microbiota dos sedimentos Um método efetivo de acesso ao sedimento enterrado é através de observatórios. Controle da pressão da amostra. Existem observatórios penetrando 300 m nos sedimentos e crostas Cowen, 2004

22. Ventarolas marinhas Baixa abundância (biomassa), porém microrganismos sempre presentes. Uso de sondas fluorescentes específicas para rRNA de Archaea e Bacteria e C radioativo para detectar atividade na crosta basáltica oceânica. Fisket al., 1998.

23. Sedimentos: • Elevada diversidade de Bacteria e Archaea • 180 reações metabólicas envolvendo N, S e C inorgânico, metais e minerais assim como compostos orgânicos • Existência de diversos micro-nichos

24. Acesso - direto Amostragem no Números de microrganismos – normalmenteelevado Solo Equipamentos - trados, pás Processamento - diluição

25. Problemas: Heterogeneidade espacial solo Distribuição dos microrganismos em agrupamentos Elevada variabilidade entre amostras Tradicionalmente 1-5 g solo Estatística

26. Solo propriamente dito Elevada população devido a riqueza nutricional da rizosfera. BIOMASSA - 1010 /g Características: 1. Micro colônias (interação ativa dentro das populações) 2. Populações com elevadas velocidades crescimento 3. Modificações ambientais locais 4. Troca genética Elevada diversidade governada pela Lei do Mínimo de Liebig. Subsolo BIOMASSA - 107/g Distribuição não homogênea

27. Alguns números sobre a estrutura do solo

28. Microrganismos no solo Em cada grama de solo tipicamente franco • 2,8 X 105 m2 - dimensões continentais para microrganismos • > 1X 1010 células viáveis • > 4 X103 espécies • < 0,1% são cultivadas in vitro • Maioria dos grupos são conhecidos apenas por informações de sequenciamento de DNA • Poucos membros cultivados pertencem a ordens conhecidas • Maioria diversidade é desconhecida!

29. Solo • Macrofauna e flora são relativamente fáceis de identificar e expressar usando riqueza específica e outros índices. • Mas as estimativas da diversidade microbiana são difíceis: • heterogeneidade, grupos difíceis de cultivar em meio de cultura • Estratégias • FAME (ésteres metílicos de ácidos graxos) • CHO (carboidratos) • Técnicas moleculares usando PCR • Sorologia

30. Amostragem no Populações - 107 /g Importantes patogênicos para homem subsolo

31. Importância Cerca de 40 % da água consumida pelo homem provem de fontes subterrâneas Existem gradientes nestas regiões que causam a movimentação dos microrganismos, como quando a água é movimentada em grandes volumes. Vírus, bactérias e protozoários tem diferentes dimensões, metabolismos, mecanismos de sobrevivência e mecanismos de transporte diferenciados. Estudo da diversidade da microbiota da subsuperficie é muito complexa.

32. Microbiota do subsolo Pesquisada nas últimas décadas (dificuldades de amostragem) Inúmeros aeróbios oligotróficos: 103-107/g Análise comunidades: Archaea e Bacteria Metanogênicas (CO2) CH4 Acetogênicas (HCO3-) acetato Bactérias redutoras de sulfatos (BRS) (SO4-2) gás sulfídrico Como vivem? Quimioautotróficos e Quimiolitotróficos

33. Como sobrevivem? A 3,4 Km abaixo da superfície Possibilidades: 1. Foram incorporados nos sedimentos durante a formação das rochas há milhões de anos e sobrevivem em condições nutricionais de “dieta mínima”. 2. Infiltraram com as águas subterrâneas a partir de águas de superfície. 3. Crescem lentamente a partir de fontes de energia inorgânicas fornecendo carbono orgânico para outros microrganismos na matriz rochosa.

34. Subsolo Recentemente descobertos 1-10 microrganismos por g de rocha (109/g de solo rizosférico) Densidade das comunidades é desconhecida: - Metabolismo microbiano é lento (dificuldade distinguir viável de inviável) - Células inviáveis são fonte nutricional para células viáveis (baixo movimento de água e nutrientes) - Difícil reproduzir as condições das profundezas em laboratório - Recentemente 9000 estirpes do subsolo foram catalogadas. - Peso dos microrganismos subterrâneos pode ser equivalente aos da superfície.

35. Não destrutivas Amostras Plantas - seiva, filosfera, tecidos Biológicas Animais - sangue, dentes, excrementos, secreções

36. Processamento Problemas: Porosidade dos filtros Composição química Concentração - centrifugação e passagem por filtros Muito raramente as populações microbianas ocorrem em concentrações apropriadas para a contagem. Enriquecimento Problemas: Composição do diluente Tempo de mistura Grau de agitação Diluição - diluições seriadas

37. Para microrganismos que metabolizam uma substância particular ou que ocorrem em baixas populações na amostra. Enriquecimento DesenvolvidoporBeijerinck Consistenapromoção de condiçõesfavoráveisespecíficaspara o crescimento de um tipo particular de microrganismo. Ex 1: paraisolar um fixador de nitrogênio o meio de enriquecimentonãopoderáconterumafonte de nitrogênio. Ex 2: bactériaquedegradanaftalenodeve-se cultivar a amostraem um meiocujaúnicafonte de carbono é o naftaleno. Ex 3: coluna de Winogradsky - enriquecimento de quimiolitotróficos. Ex 4: Para isolarBacillusformadoras de esporosdeve-se aquecer a cultura

38. Detecção dos microrganismos Métodos: Fenotípicos - baseados no cultivo ou avaliação de certas propriedades do microrganismos Imunológicos – baseados nas características sorológicas Moleculares - baseados na constituição genotípica

39. FenotípicosMétodos baratos e não requeremtreinamento diferenciado Cultivo em meio de cultura Detectar grupos que usam determinada substância ou fonte energética e que vivem em determinadas condições físico-químicas. Isolamento  cultura pura  identificação Ex: Geobacter metallireducens CH3COO- + 8Fe3+ + 4H2O  2HCO3- + 8Fe 2++ 9H+ Utilizar acetato como única fonte de C permite a detecção de microrganismos que usam ferro como fonte de energia

40. Avaliação da abundância Enumeração Atividade Biomassa Contagem direta Contagem indireta

41. Contagem direta Lâmina Petroff-Hauser ao microscópio Fluorescência, anticorpos Vantagens: Não requerem separação do microrganismo. Fornecem estimativas elevadas Desvantagens: Ás vezes distingue entre viáveis e não viáveis. Não permite análises subsequentes

42. Lâminas para contagem direta

43. Contagem indireta Contagem em placas NMP Técnica de Diluição e plaqueamento

44. Plaqueamento Diluição seriada Amplificação sinal fenotípico colônias

45. Diluições seriadas (resultado)

46. Enumeração NMP

47. NMP – número mais provável

48. Contagem indireta • Bioluminescência: detecta ATP residual • Impedância/condutância: microrganismos alteram a corrente elétrica. Vantagens: - detecção de viáveis - seletividade (uso de meios específicos) Desvantagens: - permite a contagem de somente alguns tipos - Ausência dos não cultiváveis

49. Avaliação da biomassa Parâmetro importante porque avalia os recursos energéticos disponíveis para a comunidade. Expresso em gramas e pode-se converter em energia: 4,9 Kcal/g peso seco Filtração Centrifução Pesagem Direta Indireta Proteína Peptideoglicano Quitina LPS DNA Dentre outros Baseia-se no fato de existir uma correlação direta entre a abundância de um microrganismo com alguma substância característica.

50. Avaliação da atividade Fotossíntese – taxa de produção primária Respiração - consumo de O2 ou produção de CO2 Potencial heterotrófico - taxa de absorção de substâncias marcadas com radioisótopos Atividade enzimática - lacase, celulase, nitrogenase, amilase ...