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Purificación de proteínas Fase III

Purificación de proteínas Fase III. La fase III. Utilizar los métodos cromatográficos apropiados considerando las propiedades de la proteína de interés: pI , Peso molecular, Unión a ligantes como sustratos, hormonas, compuestos que simulan a un metabolito , etc.

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Purificación de proteínas Fase III

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  1. Purificación de proteínasFase III

  2. Lafase III... • Utilizar los métodos cromatográficos apropiados considerando las propiedades de la proteína de interés: • pI, • Peso molecular, • Unión a ligantes como sustratos, hormonas, compuestos que simulan a un metabolito, etc.

  3. Cromatografía de afinidad • Se purifica a la proteína tomando en cuenta su afinidad específica por un ligando como: • su cofactor, • un anticuerpo o • un ión metálico.

  4. Carga • pI es el pH al cual la carga neta de la proteína es cero. • A bajos pH hay más cargas positivas en el ambiente entonces la proteína incrementa su carácter catiónico. • De manera opuesta ocurre a pH por arriba del pI.

  5. FASE III Efecto de la fuerza iónica en la solubilidad de la proteína • Cerca de su pI las proteínas son menos solubles • La carga neta de una proteína es positiva a valores de pH < pI, y se une fuertemente a una resina con cargas negativas o intercambiador catiónico.

  6. Intercambio iónico • Cromatografía basada en la separación de las moléculas debida a su carga eléctrica

  7. Elución de las proteínas de la columna de intercambio iónico • Cambio en la carga eléctrica de la proteína • Cambio en la carga eléctrica de la solución de elución

  8. MacroPrepHigh S Biorad

  9. Full length LDH • >gi|119920080|ref|XP_001251829.1| PREDICTED: similar to L-lactate dehydrogenase A chain (LDH-A) (LDH muscle subunit) (LDH-M) [Bostaurus] MATLKDQLIQNLLKEEHVPQNKITIVGVGAVGMACAISILMKDLADEVALVDVMEDILKGEMMDLQHGSLFLRTPKIVSGKDYNVTANSRLVIITAGARQQEGESRLNLVQRNVNIFKFIIPNIVKYSPNCKLLVVSNPVDILTYVAWKISGFPKNRVIGSGCNLDSARFRYLMGERLGVHPLSCHGWILGEHGDSSVPVWSGVNVAGVSLKNLHPELGTDADKEQWKAVHKQVVDSAYEVIKLKGYTSWAIGLSVADLAESIMKNLRRVHPISTMIKGLYGIKEDVFLSVPCILGQNGISDVVKVTLTHEEEACLKKSADTLWGIQKELQF

  10. Compute pI/MwTheoretical pI/Mw (average) for the user-entered sequence: • 10 20 30 40 50 60MATLKDQLIQ NLLKEEHVPQ NKITIVGVGA VGMACAISIL MKDLADEVAL VDVMEDILKG 70 80 90 100 110 120EMMDLQHGSL FLRTPKIVSG KDYNVTANSR LVIITAGARQ QEGESRLNLV QRNVNIFKFI 130 140 150 160 170 180IPNIVKYSPN CKLLVVSNPV DILTYVAWKI SGFPKNRVIG SGCNLDSARF RYLMGERLGV 190 200 210 220 230 240HPLSCHGWIL GEHGDSSVPV WSGVNVAGVS LKNLHPELGT DADKEQWKAV HKQVVDSAYE 250 260 270 280 290 300VIKLKGYTSW AIGLSVADLA ESIMKNLRRV HPISTMIKGL YGIKEDVFLS VPCILGQNGI 310 320 330SDVVKVTLTH EEEACLKKSA DTLWGIQKEL QF • Theoretical pI/Mw: 7.64 / 36582.62 http://www.expasy.ch/cgi-bin/pi_tool

  11. LDH músculo isoforma músculo Bostaurus similar a LDH A • Amortiguador de fosfatos pH= 7.0 • Si la LDH tiene un pI=7.64, entonces está ligeramente cargada positivamente a pH 7.0. • Tipo de resina que se necesita: Una que tenga carga negativa (un intercambiador de tipo catiónico). • Hay otras LDH que van de 6.55 hasta 8.6 entonces si bajamos el pH del amortiguador hasta 4.0-6.0 todas estarían cargadas positivamente.

  12. Ir construyendo su tabla de purificación...

  13. Preparación de la columna

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