1 / 14

Eddig csak kvali volt...

Eddig csak kvali volt. Kvantitatív proteomika 1) a frakcionálás szintjén Pl. 2D gélek összehasonlítása vizuálisan, komputer programokkal, differenciál festéssel 2) az MS-analízis során. Az MS NEM kvantitatív módszer. * a különböző molekulák nem egyformán detektálhatók

armine
Download Presentation

Eddig csak kvali volt...

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Eddig csak kvali volt... Kvantitatív proteomika 1) a frakcionálás szintjén Pl. 2D gélek összehasonlítása vizuálisan, komputer programokkal, differenciál festéssel 2) az MS-analízis során

  2. Az MS NEM kvantitatív módszer * a különböző molekulák nem egyformán detektálhatók pl. különböző peptidek relatív intenzitása nem tükrözi relatív mennyiségüket * nem minden komponenst detektálunk az elegyekből

  3. Hogy lehet ezt legyőzni? csak nagyon hasonló peptidek relatív intenzitását vethetjük össze! 1) Jelöljünk két sejt-populációt hasonlóan, de megkülönböztethetően! 2) Keverjük össze az összes fehérjét! 3) A keveréket emésszük, analizáljuk! És így kvantizhatunk!

  4. Hogyan jelölhetünk? • ICAT (Isotope-Coded Affinity Tags) – Cys-oldalláncának alkilezése, könnyű (H8) és nehéz (D8) alkil-csoporttal → amiben nincs Cys, az kiesik → a deuterált vegyület retenciós ideje kicsit hosszabb azonosítás: MS-MS alapon kvanti: MS-alapon relatív intenzitásokból ingadozás: van az 30% is!

  5. Hogyan jelölhetünk? • SILAC (Stable Isotope Labeling with amino acids in Cell Cultures) C13, N15, O18 tápanyaggal visszük be – jelölt aminosav → Olyat kell választani, ami nem alakulhat át más aminosavvá, illetve nem szintetizálódik a sejtben Tripszines emésztéshez Arg a menő! a keveréket frakcionáljuk, emésztjük, analizáljuk azonosítás MS-MS alapon kvanti a relatív intenzitásból

  6. Hogyan jelölhetünk? • tripszines emésztés H2O18-ban Két oxigén lép be, minden peptid jelölődik Rengeteg információ Még a szekvenálás is könnyebb, a C-terminális ionok csúsznak DE beszárítás a normál emésztés után, hosszú enzimes inkubáció... → veszteségek, nem specifikus hasítások

  7. Hogyan jelölhetünk? • iTRAQ ™ (Applied Biosystems) Nagyon ravasz jelölés! • amino-csoportra (N-terminus, Lys) • 4-féle stabil izotópos szerkezet, azonos additív tömeggel, de különböző fragmensekkel (m/z 114, 115, 116, 117) azonosítás és kvanti az MS-MS adatokból!

  8. iTRAQjelölés • 4 mintát kvantitatíve megkülönböztetni. • Minden peptidet jelöl, a módosítottakat is • Egyszerű a mintaelőkészítés • Jelnövelő hatású (szuperponálódik a 4-féle jel) • 20%-nál kisebb standard deviáció • Jobb minőségű CID spektrumok • Poszt-transzlációs változásokat is lehet így mérni! DRÁGA Ross et. al. MCP 2004

  9. Mi ebből a tanulság?/Take home message • Ha biológus vagy → eredj programozást és statisztikát tanulni • Ha matematikus vagy → irány a biológia • Ha proteomikával akarsz foglalkozni → tömegspektrometria sem árt

  10. Mi ebből a tanulság?/Take home message • Mennyiben lehet biológiai folyamatokat statisztikailag/matematikailag leírni? • A komputer gyors, nem hibázik, „tanulékony”, de hülye... • Mi emberek ellenben képesek vagyunk felismerni a váratlant, az újat – feltéve, hogy használjuk az eszünket....

  11. Minta kérdések • Mitől függ, mennyire jó egy adatbázis? • Mi az oka, hogy nincs tökéletesen működő adatbázis-lekereső szoftver? • Miért van szükség proteomikára? • Miért kell „jelölni” kvantitatív proteomikában? • Miért előnyös egy olyan jelölés, ami minden peptidet módosít? És valóban módosít-e minden peptidet?

  12. Hasznos web-oldalak ProteinProspector – http://prospector.ucsf.edu MS-BLAST -http://dove.embl-heidelberg.de/Blast2/msblast.html BLAST - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ European Bioinformatics Institute - http://www.ebi.ac.uk/ Szekvencia-összehasonlítás – http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html MS kezdőknek - „What is mass spectrometry” -www.asms.org

More Related