Dr Christian CARRIERE Laboratoire de bactériologie Hôpital Arnaud de Villeneuve

1. GENETIQUE BACTERIENNE Dr Christian CARRIERE Laboratoire de bactériologie Hôpital Arnaud de Villeneuve

2. A - Le chromosome bactérien • ADN double brin • « Gènes de la vie » • Protéines structurales • Protéines enzymatiques

3. Le chromosome bactérien

4. Le chromosome bactérienApplications pratiques 1 - Epidémiologie moléculaire “épidémiologie moléculaire” “épidémiologie conventionnelle”

5. Principe de l’épidémiologie moléculaire But : Comparer des isolats bactériens entre eux • Même espèce bactérienne • Coupure par 1 endonucléase • Migration électrophorétique • Profils de restriction • Comparaison des profils • = Technique d’électrophorèse en champ pulsé (ECP)

6. Variations observées sur les profils d’ECP Insertion (D) et perte (E) d’un fragment d’ADN sur le fragment de 400 kpb Gain (B) et perte (C) d’un site de restriction sur le fragment de 400 kpb Profil de référence A B C D E 500 kpb 400 kpb 200 kpb 50 kpb Nombre de différences par rapport au profil de référence 3 3 2 2

7. Interprétation de profils d’ECP

8. M 1 2 3 4 5 6 kb 436,5 194 48,5

9. Epidémiologie moléculaire Isolats de Pseudomonas aeruginosa - 1 à 7 : 7 patients différents - 8 et 9 : fibroscope Isolats de Staphylocoques - service N° 1 (1 à 5) et - service N° 2 (6 à 9) M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 kb 436,5 194 48,5

10. Le chromosome bactérienApplications pratiques 2 - Identification : genre et espèce (taxonomie) ex : Escherichia coli • Ancienne • dénaturation ou fusion de l’ADN • Tm : température de fusion • G - C % • Notion d’espèce - DTm et G-C % proches

11. banques de séquences d ’ADN PCR ADN r16S, Culture Séquençage Comparaison de séquences Nom de l ’espèce Taxonomie bactérienne moderne => Espèces rares ou difficiles à identifier par méthodes commercialisées

12. Analyse d’une séquence sur Internet 1-Aller sur un site spécifique 2- Copier la séquence à analyser 3- Envoyer la recherche

13. Identification d’une bactérie après séquençage Alignement des 2 séquences Pourcentage d’identité entre la séquence analysée et la séquence la plus proche de la banque de données Si le pourcentage est> à 97 %= même genre et espèce Si le pourcentage est < à 97 % = nouvelle espèce ou nouveau genre

14. Les plasmides • Fragments d’ADN double brin • Circulaires • Intra cytoplasmiques • Auto réplicatifs • Portent des gènes de « survie » • Adaptation à l’environnement • Résistance aux antibiotiques +++

15. B – Les variations génotypiques • Ce sont des modifications du génome bactérien essentiellement dues à des mutations • Pour le clinicien, les applications : • Virulence • Résistance acquise aux antibiotiques

16. Les variations génotypiques Que se passe t-il au niveau génomique ? • Microinsertions et microdélétions • Mutations faux sens : erreur • Mutations non sens : codon stop • Mutations ponctuelles • Idem ci-dessus • Macroinsertions et macrodélétions • Séquence de type IS (séquences d’insertion) • Transposons • Gain ou perte de gènes entiers(Résistance ATB)

17. La résistance a un support moléculaire(exemple des antituberculeux) Gènes mutés dans la résistance aux anti-tuberculeux (connus…)

18. Exemple : Mécanisme de résistance à la rifampicine • Mode d’action : • La rifampicine se fixe à la sous-unité  de l’ARN polymérase • Empêche l'initiation de la transcription • perturbe la synthèse des ARN messagers • Mécanisme de résistance : • 95% des souches portent des mutations ponctuelles dans le gène rpoB entre les codons 511 et 533 • Diminution de l'affinité de l'ARN polymérase pour la rifampicine

19. Mutations dans le gène rpoB 511 533 rpoB 522 511 513 516 526 531 533 Gln Asp Ser Leu Ser His Leu Tyr Asp Leu Arg Leu Pro Tyr Val Leu Trp Pro Leu Pro

20. Propriétés des variations génotypiques • 1 - Spontanéité • le mutant résistant préexiste à l’utilisation de l’antibiotique qui le sélectionne ATB Bactéries sensibles Bactéries résistantes à l’antibiotique ATB Population bactérienne Population bactérienne devenue résistante

21. Propriétés des variations génotypiques • 2 - Rareté • Taux de mutation = probabilité d’avoir un mutant résistant dans une population bactérienne ex : 10-5 • Probabilité d’avoir 2 mutants résistants à 2 ATB = produit des probabilités de chaque mutation • Application : Caverne pulmonaire=108 bacilles • Rifampicine : Tx mut. = 10-7 • Isoniazide : Tx mut. = 10-5 • Mutant isoniazide et rifampicine « spontané » = 10-7 x 10-5 = 10-12

23. Propriétés des variations génotypiques • 3 - Stabilité • transmissible à la descendance • 4 - Inductibilité • U.V., mutagènes…

24. SUPPORT GENETIQUE DE LA RÉSISTANCE  Résistance naturelle : chromosomique  Résistance acquise : - chromosomiques, secondaires à une mutation - extra-chromosomiques par acquisition de gènes ex : plasmides

25. C - Transferts de matériel génétique • Transformation • Conjugaison • Transduction

26. Caractéristiques communes à tous ces mécanismes de transfert Ces transferts d’ADN doivent être suivis de recombinaison génétique

27. I – La Transformation • Transfert d’un fragment d’ADN en solution d’une bactérie donatrice à une bactérie réceptrice • Ce modèle avait permis de démontrer que l’ADN était le support de l’hérédité en 1944 • Expériences de Griffith

28. La transformation

29. Exemple : transformation des pneumocoques par de l’ADN provenant de Streptocoques ORL • Les Streptocoques ORL • Sont des commensaux de la gorge, salive… • Peuvent porter des gènes de résistance aux antibiotiques • Sont sélectionnés par l’antibiothérapie • Transforment les Pneumocoques • DANGEREUX car les Pneumocoques deviennent à leur tour résistants

30. II – Conjugaison • Processus sexuel strict • Contact et appariement • Sexes différents, pili sexuels • Pont cytoplasmique • Transfert d’ADN chromosomique à sens unique, en général partiel

31. La conjugaison

32. La conjugaison : schéma

33. La conjugaison bactérienne • Intéresse surtout les bactéries à Gram négatif • N’importe quel gène peut être transféré : résistance, virulence … • Principal facteur d’évolution bactérienne • Intéresse aussi l’ADN plasmidique (plasmides conjugatifs)

34. Transfert de plasmides de résistance par conjugaison

35. III - La transduction • Transfert de fragments d’ADN bactérien par l’intermédiaire de vecteurs : bactériophages ou « phages » • Les bactériophages sont des virus infectant de façon spécifique les bactéries • Se répliquent dans la bactérie • Utilisent la « machinerie cellulaire » • Peuvent lyser la bactérie

37. La transduction soit conversion lysogénique • Expression du gène = prophage Soit cycle lytique • Réplication du phage

38. Exemples de conversion lysogénique • Production de toxines = virulence • Corynebacterium diphteriae • Toxine diphtérique : diphtérie • Streptococcus pyogenes (groupe A) • Toxine érythrogène : scarlatine

39. RESISTANCE BACTERIENNE NATURELLEACQUISE Qq souches d’une espèce Tend à se répandre Chromosomique Fixe Constante 1 espèce bactérienne 1 ATB ou 1 famille Transm. Verticale Mutations Extra-Chromosomique Chromosomique Rare Stable Spontanée 1 ATB ou 1 famille Transm. Verticale Éléments Génétiques Mobiles (Plasm., Tn.) Fréquent Contagieux Plusieurs ATB = MultiR Transm. Horizontale