Īsi par Legionella pneumophila L. pneumophila ir: Kustīga, aeroba, gram – negatīva nūjiņa;

1. Legionella pneumophila un amēbu Acanthamoeba castellanii un Dictyostelium discoideum mijiedarbību pētīšanas metodes Zane Zaļeska, LU Bioloģijas fakultāte sadarbībā ar Prof. Dr. Hubert Hilbi, Dr. Katrin Reus & PhD Student Urs Albers; Institute of Microbiology, ETH, Zurich

2. Īsi par Legionella pneumophila • L. pneumophila ir: • Kustīga, aeroba, gram – negatīva nūjiņa; • Fakultatīvs, intracelulārs parazīts, kas var nogalināt cilvēka plaušu makrofāgus un tādējādi izraisīt Leģionāru slimību; • Uztura ziņā ļoti prasīgas – mediumam atsevišķi jāpievieno cisteīns un dzelzs savienojumi; • Dabā sastopamas augsnē un ūdeņos vai to tuvumā, kur tās var veidot biofilmas; • Citi L. pneumophila saimnieki ir protozoji

3. Modernās pasaules paradokss • L. pneumophila ir sastopamas arī gaisa atsvaidzināšanas sistēmu dzesētājos lielās, plašās ēkās, piem., debesskrāpju un citu augstceltņu biroju telpās, slimnīcās un viesnīcās; • Tās pat var apmesties uz dzīvi ventilatoros, kurus lieto, lai palīdzētu pacientiem elpot; • Inficēšanās vienmēr notiek ar aerosoliem, kas ir kontaminēti ar L. pneumophila, tos ieelpojot; • Dīvainā kārtā ar Leģionāru slimību nevar saslimt kontaktējoties ar citu jau saslimušu personu!!!

4. Citi L. pneumophila saimnieki un modeļorganismi • Acanthamoeba castellanii ir amēbveida protozojs, kas ir dabā plaši sastopams vidēs, kur ir daudz ūdens. Laboratorijā tās audzē PYG mediumā 30 grādu temperatūrā • Dictyostelium discoideum ir cellular slime mold ar haploīdu 34 mb lielu genomu. Bada apstākļos agregē un veido pseidoplasmodiju. Laboratorijā tiek audzēti HL5 mediumā 23 – 25 grādu temperatūrā

5. L. pneumophila izdzīvošanas stratēģija • L. pneumophila nonāk saimniekos fagocitozes ceļā; • L. pneumophila maina klasisko fagocitozes norises procesu: fagosomas  jaunās & vēlās endosomas  endosomas + lizosomas = fagolizosomas; • Tādējādi L. pneumophilaA. castellanii un D. discoideum šūnās izveido sev labvēlīgu, īpašu vakuolu, kurā tās ir spējīgas vairoties, pēc tam saimnieka šūna tiek lizēta; • Gēnus, kas ir atbildīgi par šo izdzīvošanas stratēģiju, sauc par icm/dot (intracellular multiplication/defect in organelle trafficking) sistēmu

6. L. pneumophila un A. castellanii & D. discoideum mijiedarbību veidi • Izšķir vairākus saimnieka un patogēna mijiedarbības veidus: • Intracelulāra augšana; • Citotoksicitāte; • Fagocitoze.

7. Metodes šo iedarbību pētīšanai • Katram saimnieka un patogēna mijiedarbības veidam ir izveidotas vairākas metodes, lai konkrēto mijiedarbību varētu sīkāk raksturot. Šajā darbā tika iepazītas: • Intracelulāra augšana  intracelulārās augšanas esejas (L. pneumophila  A. castellanii) • Citotoksicitāte  citotoksicitātes esejas (L. pneumophila  A. castellanii) • Fagocitoze  gentamicīna aizsardzības esejas & plūsmas citometriskā analīze (L. pneumophila  D. discoideum)

8. Principi: A. castellanii inficē ar L. pneumophila wt (JR 32) un mutantajām formām (dG, g39, g53); MOI = 500; Lai nodrošinātu iekššūnas augšanu PYG mediumu nomaina pret AC buferi; AC buferī baktērijas nevairojas!!! Intracelulāri augušās baktērijas tiek lizētas no saimniekšūnām; Paraugu uznes uz CYE (Charcoal Yeast Extract) barotnēm; Skaita cfu (colony forming units) 3 d.p.i. Intracelulārās augšanas eseja

9. Intracelulārās augšanas esejasrezultāti MOI = multiplicity of infection jeb baktēriju skaits uz vienu saimniekšūnu

10. Principi: A. castellanii inficē ar L. pneumophila wt un mutantajām formām (MOI = 500); PYG mediums tiek nomainīts pret AC buferi; Divas dienas pēc inficēšanas paraugs tiek nokrāsots ar propīdija jodīdu; Lietojot fluorescences mikroskopu ar zaļo ierosināšanas gaismu, beigtās A. castellanii šūnas skaita; Aprēķina procentuālo attiecību Citotoksicitātes esejas

11. Citotoksicitātes esejas  rezultāti

12. Gentamicīna aizsardzības eseja Principi: • D. discoideum inkubē 2 stundas; • Negatīvajai kontrolei – citohalazīns D; • D. discoideum inficē ar L. pneumophila wt un mutanto formu icmT, (MOI = 10); • Lai nogalinātu ektracelulārās baktērijas, šūnas apstrādā ar gentamicīnu; • D. discoideum šūnas lizē ar saponīnu; • Lizātu uznes uz CYE barotnēm; • Trīs dienas pēc inficēšanas skaita cfu

13. Gentamicīna aizsardzības eseja  rezultāti

14. Principi: D. discoideum pārvieto SorC buferī, kurā maz uzturvielu; Šūnas inficē ar GFP ekspresējošām L. pneumophila wt un mutanto formu icmT baktērijām; MOI = 100; Mazgājot ar SorC buferi, eliminē ekstracelulārās baktērijas; D. discoideum šūnas ar fagocitētajām baktērijām tiek analizētas FACS (fluorescence – activated cell sorter) aparātā Plūsmas citometriskā analīze

15. Plūsmas citometriskā analīze  rezultāti  4x 64%

16. Secinājumi  kāpēc pētīt Legionella pneumophila? • Ir svarīgi pētīt saimnieka un patogēna mijiedarbības mehānismus, lietojot modeļorganismus A. castellanii un D. discoideum, jo tieši amēbas ir parādošos patogēnu dabiskie rezervuāri; • Cilvēka organismā ir amēbām līdzīgas šūnas  cilvēks– patogēnu saimnieks!!!