MARIA JOSÉ MARTÍNEZ ORTIZ R1 ONCOLOGÍA MÉDICA HGU DE ELCHE

1. ELECTROFUSION DE CÉLULAS DENDRÍTICAS SINGÉNICAS Y CÉLULAS TUMORALES PARA LA GENERACIÓN DE UNA POTENTE VACUNA TERAPEÚTICA FRENTE AL CANCER Jorgen Kjaergaard et al. Cellular Inmunology 225 (2003) 65-74 MARIA JOSÉ MARTÍNEZ ORTIZ R1 ONCOLOGÍA MÉDICA HGU DE ELCHE

2. INTRODUCCIÓN Células dendríticas: las más potentes y eficaces células presentadoras de Ag del organismo. Interdigitadas: Distribuídas en la mayoría de los órganos Muy abundantes en zonas LT de GL y bazo. En epidermis, formas inmaduras: células de Langerhans Muy eficientes en la presentación de Ag proteicos al LT. Foliculares: atrapan Ag unidos a Ac o a productos del complemento y losexpresan en su superficie para que sean reconocidos por los LB.

3. INTRODUCCIÓN Inmunidad frente a tumores CPA procesan y presentan los péptidos tumorales en susuperficie como péptidos unidos a receptores MHC tipo II Las células tumorales en sus receptores MHC tipo I presentan Ag peptídicos específicos del tumor Inmunidad frente a tumores de 2 tipos: celular y humoral. Humoral: CMCDA, CDC y opsonización Celular: LT CD8 citolíticos, células NK y macrófagos.

4. INTRODUCCIÓN • CÉLULAS PRESENTADORAS DE Ag

5. INTRODUCCIÓN • Inmunidad frente a tumores INMUNIDAD HUMORAL

6. INTRODUCCIÓN • Inmunidad frente a tumores INMUNIDAD HUMORAL

7. INTRODUCCIÓN • Inmunidad frente a tumores INMUNIDAD HUMORAL

8. INTRODUCCIÓN • Inmunidad frente a tumores INMUNIDAD CELULAR

9. INTRODUCCIÓN • Inmunidad frente a tumores INMUNIDAD CELULAR

10. INTRODUCCIÓN Inmunoterapia tumoral Control del crecimiento tumoral mediante la activación delsistema inmune. La activación de una respuesta antitumoral específica es consecuencia de la expresión por las células cancerosas de nuevos antígenos denominados tumor-específicos o tumor asociados. Inmunoterapia activa: estimulación de los componentes del sistema inmunitario responsables de la respuesta antitumoral. Vacunas antitumorales Inmunidad activa específica

11. INTRODUCCIÓN Células singénicas Diferentes células de la misma especie y genéticamente idénticas. Células alogénicas Diferentes células de la misma especie pero genéticamente no idénticas. Electrofusión Procedimiento a mediante el cual se obtienen híbridos fusionando células dendríticas y tumorales tras ser estas previamente sometidas a procesos de purificación, suspensión en medio de cultivo, centrifugación, electroforesis e incubación.

12. INTRODUCCIÓN • ELECTROFUSIÓN A.CD: rojas; Céls. Melanoma: verdes; híbridos: amarillas B.Híbrido celular: CD+ cél. melanoma C.Microscopio: fluorescencia híbrido celular con doble núcleo D.Fagocitosis de céls. melanoma por CD

13. INTRODUCCIÓN Obtención de células dendríticas • Mediante leucaféresis se seleccionan monocitos de sangre periférica que posteriormente se someten a un período de cultivo in vitro con citoquinas consiguiendose células dendríticas. • Se condiciona a estas con un estímulo de activación y maduración mediado por citokinas. • Se carga en las CD el antígeno. • Son reinfundidas de forma I.V. o intradérmica al receptor.

14. INTRODUCCIÓN • OBTENCIÓN DE CÉLULAS DENDRÍTICAS

15. INTRODUCCIÓN • La principal dificultad para el uso clínico de las CD radica en la obtención de cantidades suficientes de células, debido a que en la sangre representan sólo el 0,1% de los leucocitos y a que en el estadio inmaduro las células no poseen la capacidad de multiplicarse.

16. INTRODUCCIÓN Los principales inconvenientes que presenta el control inmunológico del cáncer es: • La dificultad para aislar antígenos tumorales específicos • Escasa capacidad inmunógena de los tumores humanos.

17. INTRODUCCIÓN • Conjugación con adyuvantes Entre las estrategias desarrolladas para potenciar y conseguir una respuesta inmune efectiva, se encuentra el proceso de conjugación del antígeno tumoral con adyuvantes ( adyuvante completo o incompleto de Freund, aluminio, liposomas,..) de alto poder inmunógeno. Los adyuvantes no necesariamente necesitan hallarse unidos físicamente al antígeno, es el caso del levamisol, el IFN-gamma, el sagramostin o la BCG.

18. INTRODUCCIÓN • INCONVENIENTES ESTUDIOS PREVIOS • El uso de células dendríticas como vehículo para la presentación de Ag tumorales débiles es teoricamente atractiva en el diseño de unavacuna terapeútica. • Estudios previos: trasfiriendo RNA y DNA derivado de tumores a las CD, estimulando las CD con células tumorales necróticas o apoptóticas, con células tumorales lisadas o con exosomas derivados de tumores.

19. INTRODUCCIÓN • INCONVENIENTES ESTUDIOS PREVIOS • Variaciones en el progenitor seleccionado para obtener CD, en los medios de cultivo utilizados y las diferencias significativas en estadio madurativo y funciones de las subpoblaciones celulares obtenidas, además de que los modelos tumorales presentan diversos grados de inmunogenicidad y de capacidad de crecimiento. • El método tradicional de fusión utilizando PEG( polietilenglicol) tiene eficacia variable, toxicidad y pobre reproductibilidad

20. OBJETIVOS Determinar: • Características de células híbridas CD-tumor generadas por electrofusión. • Requisitos para inmunoterapia efectiva con híbridos células CD-tumorales. • Uso de CD singénicas frente a alogénicas para la electrofusión. • Efectividad de inmunoterapia en tumores establecidos en diferentes órganos.

21. MATERIALES Y MÉTODOS • Ratoneshembras B6 y Balb. • Tumores. Fibrosarcomas MAC 205 y H12. H12 es un clon del MAC205 que presenta crecimiento estable. Las células cultivadas H12 son utilizadas para electrofusión y las MCA205 para establecer tumores • Electrofusión de células dendríticas y células tumorales H12.Las células dendríticas son generadas desde el bazo de Ratones B6 oBalb/c. Electrofusión de CD y tumorales poniendo células en una cámara de fusión y sometidas a dielectroforesis. • Análisis mediante citometría de flujo. Inmunofluorescencia directa

22. MATERIALES Y MÉTODOS • Inmunoterapia activa. 1. Se establecen tumores en ratones mediante inoculación de células tumorales 2. Inmunoterapia: Inyección intraesplénica de células de fusión. En algunos casos inyección intranodal. En otros inyección intraperitoneal + adyuvante:OX-40RmAb. En algunos casos aladyuvante fue 4-1BBmAb.

23. MATERIALES Y MÉTODOS 3. Valoración de eficacia terapeútica: Metástasis pulmonares: los ratones son sacrificados el día 18, se tiñen los pulmones y se hace recuento de número de nódulos pulmonares. Tumores subcutáneos: se mide el diámetro de los nódulos 2 veces por semana y se introducen los datose n una curva de crecimiento. Tumores intracraneales: monitorización del tiempo de supervivencia

24. MATERIALES Y MÉTODOS • Deplección de células T Inyeción i.v. De líquido ascítico contiene ratIgG2b mAb, que es un Ac frente a Cd4 murino o CD8. • Análisis estadístico

25. RESULTADOS 1. Características de células híbridas CD-tumor generadas por electrofusión. • CD generadas desde bazo de ratones mostraron fenotipo maduro característico con alta expresión de MHC-I y II, moléculas coestimuladoras CD80 y CD86 así como molécula de adhesión ICAM-I(CD54) en su superficie. • Células tumorales marcadas con CFSE y CD marcadas con PE-conjugado mAbs . Las células de fusión presentan doble positividad. • La electrofusión ha generado 40-60% de células híbridas

26. RESULTADOS 2. Requisitos para inmunoterapia efectiva con híbridos células CD-tumorales. • 1 inyección intraesplénica de células de fusión suficiente para reducir el número de nódulos metastásicos • La terapia eficaz requiere coadministraciónde adyuvantes:inyección de OX-40R o 4-1BB mAbs intraperitoneal • Electrofusión requiere mezcla de CD y tumorales sometidas a una incubación prolongada.

27. RESULTADOS • Solo CD+tumor son capaces de inducir una respuesta terapeútica inmune. • La inyección intraesplénica de híbridos eran eficaces. Una terapia exitosa requiere de la inyección devacuna dentro de órganos linfoides, bazo o GL. • La vía I.P. o s.c. era ineficaz. Analizar la vía i.v. para vacunación no fue factible ya que elevado tamaño de células fusión daba lugar a embolia pulmonar y muerte del receptor.

28. RESULTADOS 3. Uso de CD singénicas frente a alogénicas para la electrofusión. • La actividad significativa antitumoral fue observada solo en ratones tratados con CD singénicas. • La participación de CD4 y CD8 es necesaria para obtener una inmunoterapia eficaz con células de fusión.

29. RESULTADOS • Los ratones quefueron depleccionados de células CD4 o CD8 con la admón. de CD4 o CD8 mAbs i.v. el día previo a la vacunaciónno presentaron efectos antitumorales tras la vacunaicón. • MHC-I y MHC-II en CD4 y CD8 son necesarios para que exista un efecto terapeútico de la inmunoterapia con células de fusión. • La deplección de células T se relaciona con ineficacia de la inmunoterapia..

30. RESULTADOS 4. Efectividad de inmunoterapia en tumores establecidos en diferentes órganos. • Tumor en piel: se observó retraso del crecimientotumoral en 6 de 10 ratones tratados. • Tumor intracraneal:se observó una supervivencia prolongada en 3 de 6 ratones tratados. • 3 ratones curados de tumor intracraneal son sometidos 60 días después a una nueva inoculación de tumor. No desarrollaron un nuevo tumor, mientras que el grupo control moría a los 20 días por tumor intracraneal. Se concluye que las células de fusión CD-tumor inducen memoria inmunológica a largo plazo. • La eficacia de la inmunoterapia requiere utilización de CD y adyuvante

31. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES • La fusión de membranas es un paso fundamental en multitud de procesos celulares tal como: exocitosis, endocitosis, fertilización, mitosis, miogénesis. • La fusión celular inducida por agentes químicos ha proprocionado un modelo útil para conocer el proceso de fusión celular. En este estudio se expone que la fusión celular tambien se puede llevar a cabo sometiendo a células a campos eléctricos. • La electrofusión no requiere sustancias fusógenas y el proceso es sincrónico e instantáneo.

32. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES • Si dos células están en contacto durante el proceso de depresión de membrana lamformación de poros microscópicos que se produce lleva a la formación de canales y finalmnete a la formación de una célula híbrida esférica. • Los autores sometieron a las células a corriente eléctrica alterna para inducir un bipolo eléctrico en la célula. Este proceso se denomina dielectroforesis.

33. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES • Se demuestra la eficacia de la electrofusión para crear híbridos de fusión CD-tumor, terapeúticamente eficaces, en el tratamiento de tumores químicamente inducidos. • Las células de fusión CD-tumor tienen la propiedad posibilidad de estimular las células TCD4 y CD8; la respuesta de las células Tva a mediar en la regresión tumoral. • Los híbridos eficaces son los generados desde CD singénicas.

34. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES • Se demuestra la eficacia de la electrofusión para crear híbridos. • La inmunoterapia eficaz requiere administración de células de fusión más adyuvantes así como la presencia de células T CD4 y CD8. • OX-40R y4-1BBmAb son eficaces adyuvantes. • La mayor eficacia de la inmunidad inducida frente al tumor se logra con la vacuna inoculada en bazo.

35. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES • La eficacia terapeútica de la inmunoterapia se demuestra para tumores establecidos en el pulmón, pero no así frente a los tumores intracraneales. • El SNC es considerado privilegiado desde el punto de vista inmunológico, ya que carece de drenaje linfático y la naturaleza de la barrera hematoencefálica con uniones intercelulares supone una barrera física al paso de agnetes químicos, anticuerpos y células.

36. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES • La electrofusión de las células tumorales irradiadas son la fuente de obtención de Ag tumorales. • Las células tumorales tambien continen Ag presentes en tejidos normales, lo que limita su uso. • La electrofusión comparada con otros métodos de fusión es un proceso que permite obtener numerosas células de elevada eficacia y con fácil reproductibilidad.

37. VACUNA CANCER TIPO DE ENSAYO Péptidos sintéticos de epitopos de Ig de Linfocitos B tumorales Leucemia Linfocítica Fase1 Células autólogas tumorales de colon con BCG con estimulante inespecífico Colon Fase3 Lisado polivalente de células de melanoma; adyuvante Detox Melanoma Fase3 Ag múltiples procedentes de cuatro líneas celulares de melanoma; ady. alumbre Melanoma Fase3 Células de melanoma irradiadas Melanoma Fase3 Ag clonado, Jen CRG Colorrectal y pulmón Fase1 ENSAYOS CLÍNICOS CON VACUNAS ANTITUMORALES