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Virus recombinant et vaccination

Virus recombinant et vaccination. Exemple de la rage FLICOTEAUX Pascal GARCON Sylvain. Rhabdovirus. RNA monocat-, 11-15 Kb Une seule glycoprotéine: G. Principe. Le but est d’insérer le gène codant pour la glycoprotéine rabique dans un virus (virus de la vaccine)

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Presentation Transcript

  1. Virus recombinant et vaccination Exemple de la rage FLICOTEAUX Pascal GARCON Sylvain

  2. Rhabdovirus • RNA monocat-, 11-15 Kb • Une seule glycoprotéine: G

  3. Principe • Le but est d’insérer le gène codant pour la glycoprotéine rabique dans un virus (virus de la vaccine) • L’ensemble est injecté, la glycoprotéine est exprimée immunisation

  4. Préparation de l’insert • Etape 1: excision de la queue polydG ATG TAC ATG TAC ATG Oligonucléotide double brin TAC ATG= codon initiateur

  5. Préparation de l’insert Préparation de l’insert • Etape 2: correction de l’aa n°8 CTA ATG GAT TAC CCA GGT CCA ATG GGT TAC Hind III

  6. Préparation du plasmide tk ADN viral Hind III Gène Thymidine kinase tk clonage

  7. Préparation du plasmide tk Promoteur précoce + tk insert + Tk - Hind III

  8. Production de virus recombinant Ca2+ Insert Géne nts Virus vaccinal ts Culture de cellule Ts = thermosensible, nts = non ts

  9. Sélection des recombinants • Incubation à température non permissive Recombinants nts Culture de cellule

  10. Sélection des recombinants • Culture sur cellules tk - Recombinants nts et tk- Culture de cellule + BrdUrd BrdUrd = substrat tk

  11. Vérification • Digestion ADN par Hind III • Electrophorèse: • 2 fragments (1,1 + 5,5 Kb): OK • Si 1 fragment (4,6 Kb): non recombinant • Southern blotting: hybridation avec DNA de la glycoprotéine rabique

  12. Préparation du plasmide tk Promoteur précoce + tk insert + Tk - Hind III

  13. Essais in-vitro • Infection cellules tk- • Forte immunofluorescence avec des Ac anti-gp • La synthèse est donc efficiente • Immunoprécipitation: par sérum polyclonal autant que par 2 Ac monoclonaux (bande à PM de 66000: correspond à la glycoprotéine rabique)

  14. Essais in-vivo • Injection intra-dermique chez la souris: résiste à des épreuves d’infection à haute dose

  15. Conclusion • La glycoprotéine produite est qualitativement indistingable de la protéine native • Les virus atténués comme le virus vaccinal sont des vecteurs particulièrement appropriés pour la production de vaccins (à été utilisé pour smallpox, hépatite B, influenza et herpès)

  16. Biblio • Kieny M.P. et al., 1984 : expression of rabies virus glycoprotein from a recombinant vaccinia virus. Nature, 312, 163-166 • Blancou J. et al., 1986 : oral vaccination of the fox against rabies using a live recombinant vaccinia virus. Nature, 322, 373-375 • Pastoret P.P. & Brochier B., 1996: the developement and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur. Epidemiol. Infect., 116, 235-240

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