Travail de thèse réalisé au sein de l’unité INSERM U549

1. IMPLICATION DE GHRELINE/OBESTATINE, DEUX PEPTIDES ISSUS DU MEME PRECURSEUR, DANS LE CONTRÔLE DE LA SECRETION D’HORMONE DE CROISSANCE ET DU COMPORTEMENT ALIMENTAIRE Travail de thèse réalisé au sein de l’unité INSERM U549

2. Régulation de la sécrétion de GH et du comportement alimentaire Facteurs intra-hypothalamiques, extra-hypothalamiques Sécrétion de GH Contrôle de la PA SRIH OT/AVP CRH TRH MCH ORE MCH/CART POMC/CART GHRH NPY/AgRP

3. SRIH OT/AVP CRH TRH MCH ORE MCH/CART POMC/CART GHRH NPY/AgRP Régulation de la sécrétion de GH et du comportement alimentaire Facteurs intra-hypothalamiques, extra-hypothalamiques Sécrétion de GH Contrôle de la PA Facteurs périphériques Leptine Ghreline

4. Jour Nuit Prise alimentaire (min/30min) 10h20 14h20 17h20 10 12 14 16 Temps (h) Tolle, Bassant, Zizzari et al., 2002

5. Quel est le rôle de la ghreline endogène dans la régulation • de la sécrétion de GH ? • du comportement alimentaire ?

6. Ghreline octanoylée Ghreline non octanoylée Sécrétion spontanée de ghreline

7. Sécrétion spontanée de ghreline Anticorps N terminal Ghreline octanoylée Ghreline non octanoylée ghrelineoctanoylée

8. Sécrétion spontanée de ghreline Anticorps N terminal Anticorps C terminal Ghreline octanoylée Ghreline non octanoylée ghrelineoctanoylée ghrelinetotale

9. r=0,73 P<0,0001 Ghreline Totale (pg/ml) Ghreline octanoylée (pg/ml) Sécrétion spontanée de ghrelinetotale et de ghrelineoctanoylée Cluster Taux moyens (pg/ml) Nadir (pg/ml) Amplitude des pics (pg/ml) Nombre de pics/8h Intervalle entre 2 pics (min) 4620±820 3067±320 5375±603 2,5±0,3 137±15 887±105 637±98 1352±173 2,7±0,4 117±10

10. Sécrétion spontanée de ghrelinetotale ou octanoylée et d’hormone de croissance Cluster ApEn Taux moyens Nadir Amplitude des pics Nombre de pics/8h Intervalle entre 2 pics (min) Sur 8 rats : pas de corrélation individuelle ou globale (r=0,1189; P=0,0959) entre GH et ghreline octanoylée ou entre GH et ghreline totale 4620±820 3067±320 5375±603 2,5±0,3 137±15 0,899±0,042 887±105 574±101 1453±258 1,9±0,3 168±21 0,890±0,036 17,3±2,8 10,9±2,2 36±6 2,6±0,3 139±21 0,814±0,029

11. Caractérisation in vitro et in vivo du BIM-28163, un antagoniste du GHS-R 1a * 2500 2000 Sécrétion de GH (AUC) 1500 1000 500 0 - 500 Vehicle + Vehicle BIM-28163 + Vehicle Vehicle + hGhrelin BIM-28163 + hGhrelin * 5000 * 4000 Sécrétion de GH (AUC) 3000 2000 1000 0 Vehicle + Vehicle BIM-28163 + Vehicle Vehicle + hGHRH BIM-28163 + hGHRH Mobilisation du [Ca2+]i (% des Contrôles) Zizzari et al., 2005

12. Effet sur la sécrétion de GH d’un traitement de 48 heures par le BIM-28163 Prélèvements sanguins toutes les 20 min. de 10h à 16h (J0 et J1) J-6 J-5 J-4 J-3 J-2 J-1 J0 J1 Sérum physiologique BIM Sérum f Sérum f BIM Zizzari et al., 2005

13. Les résultats obtenus avec deux approches différentes montrent que : 1- Ghreline et GH sont sécrétées toutes 2 de manière épisodique avec une fréquence d’apparition des pics comparable. Néanmoins dans nos conditions nous n’observons pas de corrélation stricte entre taux de ghreline et taux de GH 2- La ghreline octanoylée est capable de moduler l’amplitude des pics de GH suggèrent que : La ghreline octanoylée n’interviendrait pas dans la genèse de la pulsatilité mais amplifierait le patron de sécrétion

14. Ghreline octanoyléeet prise alimentaire Dans 79% Dans 77%  20±4%  15±2% 30 min 30 min Episode de PA

15. Effet du traitement ICV par le BIM-28163, sur la prise alimentaire J-6 J-5 J-4 J-3 J-2 J-1 J0 J1 Sérum f BIM Sérum f Mesure en continu de la prise alimentaire et de la boisson Zizzari et al., 2005

16. Pourquoi l’antagoniste qui est capable de diminuer l’amplitude des pics de GH n’a-t-il pas d’effet sur la prise alimentaire ? • Les récepteurs qui contrôlent la sécrétion de GH et la prise alimentaire sont-ils différents? • Les récepteurs GHS-R1a présents sur les neurones impliqués d’une part dans le contrôle de la sécrétion de GH d’autre part dans le contrôle de la prise alimentaire sont-ils dans un état d’activation différent?

17. Bien que la corrélation entre ghreline octanoylée et prise alimentaire soit meilleure qu’entre ghreline et GH • tous les pics de ghreline ne sont pas suivis d’un épisode de prise alimentaire (15/29) • les souris qui n’ont plus de ghreline consomment la même quantité de nourriture que les animaux contrôles

18. Zhang, 2005 Est-ce que l’existence de l’obestatine peut permettre de comprendre pourquoi il est difficile de mettre en évidence le rôle de la ghreline endogène dans la régulation de la sécrétion de GH et du comportement alimentaire. Obestatine = un peptide issu du même précurseur que la Ghreline et présentant des effets opposés à ceux de la ghreline

19. Obestatine, et sécrétion de GH (10 µg/rat) Zizzari et al., 2007

20. Obestatine, et prise alimentaire 16h 17h 19h 21h 5h 10h 5h 17h 5h 17h +1h C57Bl6J, mâle de 12 semaines Ad libitum Jeûne injections+ accès à la nourriture +3h +5h +18h Zizzari et al., 2007

21. En résumé Dans certaines conditions : • Obestatine inhibe partiellement • l’effet de la ghreline • sur GH • sur la prise alimentaire

22. Ghreline etObestatine Ghreline/Obestatine(nmole/L) Temps (h) Zizzari et al., 2007

23. Ghreline etObestatine Ghreline/Obestatine(pmole/L) Temps (h) Cluster Corrélation ghreline/obestatine Individuelle : 3/8 rats, r2=0.315 ; 0.399 ; 0.357, avec P=0.0125, 0.0049, 0.0069 Globale : r2=0.0297, P=0.0344 Taux moyens (pmole/L) Nadir (pmole/L) Amplitude des pics (pmole/L) Nombre de pics/6h Intervalle entre 2 pics (min) 358±25 259±21 452±21 2,25±0,25 85±14 317±8 253±12 385±17 1,50±0,27 117±52 Zizzari et al., 2007

24. L’obestatine est sécrétée de façon épisodique mais il n’existe qu’une faible corrélation entre les taux de ghreline octanoylée et ceux d’obestatine. Est-ce que ghreline et obestatine sont libérées par les mêmes cellules, sont-elles régulées parallèlement ou indépendamment ?

25. Obestatine et statut nutritionnel

26. L’ensemble des résultats obtenus au cours de cette étude nous a conduit à faire l’hypothèse que l’effet de la ghreline endogène sur la sécrétion de GH et sur le comportement alimentaire dépendrait : • Du tonus des autres neuropeptides impliqués dans ces régulations (SRIH pour GH, NPY et POMC pour prise alimentaire) • Du rapport ghreline/obestatine

27. Quel est le rôle de la ghreline endogène dans la régulation • de la sécrétion de GH ? • du comportement alimentaire ? • En retour est-ce que GH et état nutritionnel interviennent dans la régulation de la sécrétion de ghreline ?

28. Influence de la GH sur la libération de ghreline

29. Chez le Rat Chez l’Homme

30. Régulation de la ghreline par l’état nutritionnel

31. Anorexie nerveuse Sujets : Témoins, Anorexiques avant et après renutrition, maigreurs constitutionnelles ** *** *** *** *** ** * Tolle et al., 2003

32. ** *** *** *** *** ** * Anorexie nerveuse Sujets : Témoins, Anorexiques avant et après renutrition, maigreurs constitutionnelles Les taux de Ghreline dépendent plus de l’état nutritionnel que de la masse grasse. Tolle et al., 2003

33. Modèle d’obésité et d’hyperphagie chez le rat Rat Zucker : obèse, hyperphage, resistant leptine et insuline Rat Wistar de même âge Rubino, Zizzari et al., 2005

34. Le Bypass « Roux-en-Y » Une des chirurgies bariatriques les plus efficaces pour le traitement de l’obésité morbide. Réduction de la capacité gastrique et dérivation de la majorité de l’estomac, du duodénum et d’une partie du jéjunum BDJ Effets différents sur la sécrétion de ghreline suivant les études. Est-ce que ces différences proviennent : de l’exclusion de parties différentes de l’estomac ou de dérivations variables de l’intestin ? AG

35. Chirurgie bariatrique, Prise alimentaire, gain de masse corporelle et sécrétion de ghreline 40 40 30 30 20 20 10 10 30 20 10 0 Sham Prise alimentaire (g) Wistar Zucker Ces résultats suggèrent que des facteurs en provenance de l’intestin pourraient contrôler la sécrétion de ghreline. Une altération de ce système pourrait participer au développement de l’obésité Sham BDJ Sham AG BDJ BDJ Gain de masse corporelle (g) 40 30 20 Sham BDJ Sham AG BDJ Rubino, Zizzari et al., 2005

36. Quel est le rôle de la ghreline endogène dans la régulation • de la sécrétion de GH ? • du comportement alimentaire ? • En retour est-ce que GH et état nutritionnel interviennent dans la régulation de la sécrétion de ghreline ? • Est-ce que la ghreline est impliquée dans la vulnérabilité de certains sujets vis-à-vis de l’anorexie mentale ?

37. Chez l’anorexique le polymorphisme Leu72Met présente un déséquilibre de transmission qui est plus marqué chez les patientes ANB que chez les patientes ANR Est-ce que ce polymorphisme entraine une altération de la maturation de la pré-pro-ghreline ? Leu72Met (C/A) Gln90Leu (A/T) 114 trios : Patiente (Diagnostic : ANR ou ANB), Père, Mère T/NT P Leu72Met (C/A) 21/6 0.004 Gln90Leu (A/T) 7/14 0.13 ANR 8/4 0.25 5/7 0.56 ANB 13/2 0.005 2/7 0.096 Dardennes, Zizzari et al., 2007

38. Conclusions/Perspectives (I) • Ghreline et obestatine, deux peptides issus du même précurseur, sont libérées dans la circulation sanguine de façon rythmique • Néanmoins : • la fréquence d’apparition des pics de ghreline et d’obestatine est légèrement différente • il n’y a pas de corrélation stricte entre taux de ghreline et d’obestatine • ghreline et obestatine semblent régulées différemment au cours du jeûne • Ces résultats suggèrent l’existence de régulations différentes de la synthèse et/ou de la libération de ghreline et d’obestatine • Questions posées : • ghreline et obestatine sont-elles maturées par les mêmes protéines convertases ? • sont-elles produites par les mêmes cellules ? • est-ce que leur libération est régulée par les mêmes facteurs ?

39. Conclusions/Perspectives (II) Alors que l’injection de ghreline entraîne immédiatement une très forte augmentation de la libération de GH, il n’existe pas de relation stricte entre pics de ghreline et pics de GH. Néanmoins la ghreline endogène est capable de moduler l’amplitude des pics spontanés de GH. Dans certaines conditions l’obestatine sans effet par elle-même inhibe partiellement l’effet de la ghreline sur la sécrétion de GH • Questions posées : • notre dosage reconnaissant probablement à la fois la ghreline octanoylée libre et liée, est-ce que les pics de ghreline libre seraient mieux en relation avec ceux de GH ? • est-ce que la ghreline ne peut augmenter la sécrétion de GH que dans certaines conditions, comme par exemple en dessous d’un certain seuil du tonus somatostatinergique ? • est-ce que l’effet de la ghreline dépend du rapport ghreline/obestatine

40. Conclusions/Perspectives (III) Il existe une bonne relation entre modifications des taux de ghreline et prise alimentaire. Néanmoins, tous les pics de ghreline ne sont pas suivis par une augmentation de prise alimentaire. Dans certaines conditions, l’obestatine est capable de bloquer partiellement l’effet de la ghreline sur la prise alimentaire. • Questions posées : • est ce que des modifications des taux d’obestatine sont observées en fonction des épisodes de prise alimentaire ? • quel est le rôle de l’obestatine endogène et du rapport ghreline/obestatine ? La sécrétion de ghreline dépend de l’état nutritionnel et serait en partie régulée par des facteurs en provenance de l’intestin • Questions posées : • est ce que les taux d’obestatine dépendent de l’état nutritionnel ? • peut-on identifier les facteurs intestinaux qui réguleraient ghreline et peut être obestatine ?

41. Le rôle de la ghreline dans la régulation de la sécrétion d’hormone de croissance et du comportement alimentaire devra être réévalué en tenant compte de l’existence de l’obestatine. ghreline obestatine