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Dottorato di Ricerca in: Tecnologie delle Sostanze Biologicamente Attive XIX Ciclo

Ministero dell’Università e della Ricerca Scientifica e Tecnologica. Università di Palermo. Università di Catania. Dottorato di Ricerca in: Tecnologie delle Sostanze Biologicamente Attive XIX Ciclo. IMPIEGO DI CICLODESTRINE MODIFICATE PER LA VEICOLAZIONE DEI FARMACI. Dott. Ignazio Giannone.

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Dottorato di Ricerca in: Tecnologie delle Sostanze Biologicamente Attive XIX Ciclo

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  1. Ministero dell’Università e della Ricerca Scientifica e Tecnologica Università di Palermo Università di Catania Dottorato di Ricerca in:Tecnologie delle Sostanze Biologicamente Attive XIX Ciclo IMPIEGO DI CICLODESTRINE MODIFICATE PER LA VEICOLAZIONE DEI FARMACI Dott. Ignazio Giannone Relatore Coordinatore Chiar.mo Prof. Giovanni Puglisi Chiar.mo Prof. Gaetano Giammona

  2. OUTLINE Proprieta´ chimiche e capacita´ complessanti 10000 1000 Produzione industriale e applicazione diffusa Numero cumulativo di pubblicazioni Analisi Strutturali 100 10 1980 2007 1 1900 2000 1920 1940 1960 Anni • Ciclodestrine: struttura e proprietá • Scopo della ricerca • Studi di complessazione del Disoxaril • Studi di complessazione del Celecoxib • Studi di complessazione dell´Amiodarone • Considerazioni finali

  3. OUTLINE • Ciclodestrine: struttura e proprietá • Scopo della ricerca • Studi di complessazione del Disoxaril • Studi di complessazione del Celecoxib • Studi di complessazione dell´Amiodarone • Considerazioni finali

  4. CICLODESTRINE • Formaa tronco di cono [conformazione a sedia]. Faccia primaria Interno idrofobico Esterno idrofilo RAMEB EPC-CD HPBCD SBET Faccia secondaria DIMEB solubilità e affinità per lipofili • Oligosaccaridi ciclici, prodotti di degradazione e • ciclizzazione enzimatica dell’amido (Villiers). • Costituiti da 6, 7 o 8 unità di D(+)glucosio (α, β, γ). • Superficie interna lipofila [H(3), H(5) e O(4)]. • Superficie esterna idrofila [-OH]. Cyds di semisintesi • Modificarne la solubilità • Capacita complessanti • Introdurre gruppi specifici

  5. CICLODESTRINE Modificazione delle caratteristiche chimico-fisiche e biofarmaceutiche delle molecole incluse • Vantaggi • Solubilitá • Stabilitá • Biodisponibilitá (host) molecola guest • Complessi di inclusione • Microincapsulazione molecolare • Interazioni deboli

  6. CICLODESTRINE Assenza di tossicità T.G.I. Cyds naturali Cyds modificate Nessun metabolismo (Maltodestrine, maltosio, Glucosio, CO2 e H2O) (ingombro sterico) Complesso solido F-Cyd Dissoluzione Kc Cyd Farmaco Promotore di assorbimento Tratto g.i. + Complesso dissolto Ka Assorbimento Membrana g.i. Sangue Farmaco VIA ORALE

  7. CICLODESTRINE Via percutanea • Non vengono assorbite dalla pelle • Mostrano elevato potere solvente • Non mostrano effetti irritanti locali • Modulano il rilascio

  8. OUTLINE • Ciclodestrine: struttura e proprietá • Scopo della ricerca • Studi di complessazione del Disoxaril • Studi di complessazione del Celecoxib • Studi di complessazione dell´Amiodarone • Considerazioni finali

  9. SCOPO DELLA RICERCA Valutare come la complessazione con Cyds è in grado di modificare le diverse caratteristiche chimico-fisiche dei farmaci selezionati. Farmaci • Disoxaril • Celecoxib • Amiodarone Cyds • DM-β-Cyd • HP-β-Cyd

  10. OUTLINE • Ciclodestrine: struttura e proprietá • Scopo della ricerca • Studi di complessazione del Disoxaril • Studi di complessazione del Celecoxib • Studi di complessazione dell´Amiodarone • Considerazioni finali

  11. IL DISOXARIL 5-[7-[4-(4,5-DIIDRO-2-OXAZOLIL)FENOXI]EPTIL]-3-METIL-ISOXAZOLO • Attivitá antivirale (Rinovirus). • Non commercializzato. • Scarsa solubilità in H2O. • Chimicamente instabile. • Tossicitá renale (Cristalluria). • Somministrazione topica nasale. Cyd selezionata DM-β-Cyd HP-β-Cyd

  12. METODI • Preparazione (kneading). • Caratterizzazione allo stato solido (DSC). • Caratterizzazione in soluzione (UV, DC, 1H-NMR, Diagrammi di solubilitá di fase, Studi di Stabilitá). • Studi permeazione in vitro (mucosa nasale bovina). • Studi in vivo di tollerabilitá intranasale (coniglio). • Analisi istopatologica delle cavitá nasali trattate.

  13. CARATTERIZZAZIONE ALLO STATO SOLIDO: DSC Passaggio da uno stato amorfo ad uno cristallino (picco esotermico a 130°C) Interazione allo stato solido (R.M. 1:2) A B B C ENDO D E 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 Temperatura (°C) DISOXARIL-DM-β-Cyd 100°C A) Disoxaril libero; B) DM--Cyd; C) miscela fisica Disoxaril-DM--Cyd rapporto molare 1:2; D) complesso Disoxaril-DM--Cyd rapporto molare 1:1; E) complesso Disoxaril-DM--Cyd rapporto molare 1:2.

  14. Aumento intensitá delle bande a 260 nm (π→ π* del nucleo aromatico fenilico) e a 211 nm (n→π* del nucleo isossazolinico). Pertubazione del microintorno dei cromofori elettronici del Disoxaril. Disoxaril integro 260 nm → 290 nm Disoxaril degradato 260 nm 2,0 Dix-DM--Cyd (1:40) Dix-DM--Cyd (1:10) Dix-DM--Cyd (1:2) Dix-DM--Cyd (1:1) Dix libero 1,000 ABS B D A ABS C 1,0 0,000 0,0 200 250 300 350 Esistenza di un complesso di inclusione in soluzione acquosa. 200 250 300 350 Lunghezza d’onda (nm) Lunghezza d´onda (nm) Spettri del Disoxaril libero in HCl: integro (A), degradato (B), in metanolo/tampone integro (C) e degradato (D). Esclusione del gruppo ossazolinico CARATTERIZZAZIONE IN SOLUZIONE ACQUOSA: UV

  15. 1:40 Disoxaril-DM-β-Cyd 1:10 Nessuna banda DC per Disoxaril libero Due bande indotte (DCI) • negativa (211 nm) • positiva (260 nm) Esistenza di un complesso di inclusione in soluzione acquosa Lunghezza d´onda (nm) 2.00 1.00 Ellitticita´Molare (10–4) 0.00 -1.00 -2.00 200 220 240 260 280 300 CARATTERIZZAZIONE IN SOLUZIONE ACQUOSA: DC

  16. Protoni Disoxaril libero Complesso di inclusione Disoxaril-DM--Cyd * H4 4.001 4.011 0.010 H5 4.482 4.498 0.016 H7-11 7.822 7.848 0.026 H8-10 6.988 6.974 -0.014 H13 4.063 4.068 0.005 H14 1.803-1.733 -- -- H15-18 1.520-1.495 -- -- H16-17 -- -- -- H19 2.755 2.775 0.020 H24 6.045 6.060 0.015 Inclusione R.M. 1:2 H25 2.223 2.245 0.022 *= complesso-libero CARATTERIZZAZIONE IN SOLUZIONE ACQUOSA: 1H-NMR Shifts • Campi bassi H7-11 e H4-5 • Campi alti H8-10 • Campi bassi H24 e H25 - Cambiamento della polaritá locale o effetto dechermante. - Effetto schermante

  17. Protoni DM--Cyd Complesso di inclusione Disoxaril-DM--Cyd * H-1 5.098 5.144 0.046 H-2 --- -- -- H-3 3.942 3.886 -0.056 H-4 3.704 3.715 0.011 H-5 3.860 3.785 -0.075 H-6 3.757 3.767 0.010 Metil-2’ 3.646 3.641 -0.005 Metil-6’ 3.472 3.482 0.010 H Inclusione R.M. 1:2 4 6 O CH 3 O 5 H O H 3 H 2 H H 1 O CH 3 O 7 CARATTERIZZAZIONE IN SOLUZIONE ACQUOSA: 1H-NMR Shifts • Campi alti H 3 e H 5 • Campi bassi H 1 e H 4 • Effetto schermante correnti anisotropiche gruppi aromatici. • Cambiamento della rigiditá del macrociclo. *= complesso-libero

  18. Inclusione del Disoxaril *= complesso-libero CARATTERIZZAZIONE IN SOLUZIONE ACQUOSA: 1H-NMR

  19. Temperature (°C) K1:1 (M-1) K1:2 (M-1) Costanti di stabilitá (K) 5 31735 71 AP 15 29010 55 25 26784 41 Conc. Disoxaril (10-5 M) Parametri termodinamici Conc. DM-β-Cyd (10-3 M) Solubilitá del Disoxaril a 25°C Temperature: () 5, (■) 15, (▲) 25°C. Complessi H S G • Disoxaril 0.000123 mg/ml • Disoxaril-DM-β-Cyd 0.5 mg/ml R.M 1:1 -1.396 15.572 -5.726 R.M 1:2 -4.536 -7.826 -2.354 DIAGRAMMI DI SOLUBILITÁ DI FASE

  20. Costanti di degradazione e t90 T (°C) Koss 10-3 (giorni-1) t90 (giorni) 37 34.76 3.02 Log conc. (%) residua 30 22.10 4.75 25 15.86 6.61 10 9.58 10.95 Giorni 4 6.87 15.27 STUDI DI STABILITÁ Profili di degradazione del Disoxaril in presenza di 1.5 % (w/v) DM--CD a differenti temperature. () 4  0.5 °C; () 10  0.5°C; ()25  0.5 °C; () 30  0.5 °C; () 37  0.5 °C. Il Disoxaril libero degrada del 100% in 3 giorni a 4°C

  21. STUDI DI PERMEAZIONE IN VITRO () Disoxaril libero; () Disoxaril con 1.5% (p/v) di DM--CD. Disoxaril permeato (%) Tempo (h) Celle di tipo Franz Mucosa nasale bovina Disoxaril → 1.24% Disoxaril-DM-β-Cyd → 22.14%

  22. STUDI DI TOLLERABILITÁ NASALE IN VIVO • Non è stato trovato alcun segno clinico attribuibile al trattamento su tutti gli animali. • L´esame necroscopico non ha dimostrato anormalitá negli organi interni. • L´esame microscopico ed istopatologico delle cavitá nasali, dei seni paranasali e della cavitá nasofaringea non ha rivelato anormalitá imputabili al trattamento. • I risultati indicano che il prodotto è ben tollerato e non provoca effetti sulla mucosa nasale anche in seguito a somministrazioni ripetute.

  23. CONCLUSIONI • La DM-β-Cyd è in grado di includere il Disoxaril sia allo stato solido sia in soluzione aumentandone la solubilità e la velocità di dissoluzione. • Tutte le metodiche utilizzate sembrano dimostrare la presenza di un complesso di inclusione Disoxaril-DM--Cyd in rapporto stechiometrico 1:2. • Si osserva una riduzione della velocità di idrolisi del Disoxaril in presenza della DM--Cyd; dopo 15 giorni, a 4 °C, il 90% di farmaco é integro (36 h farmaco libero).

  24. CONCLUSIONI • Gli studi di permeazione in vitro su mucosa nasale bovina evidenziano che durante le prime ore che seguono l’applicazione non si osserva nessun assorbimento sistemico del principio attivo. • I risultati della tollerabilitá intranasale condotti in vivo su coniglio hanno dimostrato l´assenza di effetti tossici imputabili alla somministrazione del complesso. • Le analisi istopatologiche delle cavitá nasali e degli organi interni delle cavie non hanno dimostrato anormalitá micro-macroscopiche in seguito a somministrazioni ripetute. C.A. Ventura, I. Giannone, T. Musumeci, R. Pignatello, L. Ragni, C. Landolfi, C. Milanese, D. Paolino and G. Puglisi. Eur. J. Med. Chem. (2006) 233-240.

  25. OUTLINE • Ciclodestrine: struttura e proprietá • Scopo della ricerca • Studi di complessazione del Disoxaril • Studi di complessazione del Celecoxib • Studi di complessazione dell´Amiodarone • Considerazioni finali

  26. IL CELECOXIB 4-[ 5-( 4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-1-H-pirazol-1-il] benzensulfonammide • Inibitore selettivo COX-2. • Nessuna formulazione liquida. • Nessuna formulazione topica. • Scarsa solubilità in H2O. • Tossicità cutanea. • Via orale e transdermica. Cyds selezionate • DM-β-Cyd • HP-β-Cyd

  27. METODI • Preparazione (kneading, freeze-drying). • Caratterizzazione allo stato solido (DSC). • Caratterizzazione in soluzione (DC, 1H-NMR, diagrammi di solubilitá di fase, studi di dissoluzione). • Studi permeazione in vitro (CaCo-2 cells). • Studi di permeazione in vitro (SCE). • Analisi istologica di SCE trattati.

  28. CARATTERIZZAZIONE ALLO STATO SOLIDO: DSC Termogrammi CCB-DM-β-Cyd A B C ENDO D E 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 Temperatura (°C) A) CCB p.f. 160°C B) DM-β-Cyd C) Kneading e freeze-drying D) Miscela fisica R.M. 1:1 E) Miscela fisica R.M. 1:2 Nuova fase a 250°C per effetto del calore

  29. CARATTERIZZAZIONE ALLO STATO SOLIDO: DSC Termogrammi CCB-HP-β-Cyd • A • B ENDO • C • D 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 Temperatura (°C) A) CCB p.f. 160°C B) HP-β-Cyd C) Miscela fisica R.M. 1:2 D) Freeze-drying R.M. 1:2 Nessuna interazione

  30. 2.00 CCB-DM-β-Cyd 280 nm 1.00 Nessuna banda DC per il CCB libero 0.00 Due bande indotte (DCI) -1.00 Ellitticità Molare (10–4) • negativa (240 nm) n* -2.00 • positiva (280 nm) * -3.00 Esistenza di un complesso di inclusione in soluzione acquosa -4.00 240 nm -5.00 CCB-HP-β-Cyd Lunghezza d’onda (nm) Nessuna banda DC indotta per tutti i rapporti molari CCB libero (), CCB-DM-β-Cyd R.M. 1:10 (), CCB-DM-β-Cyd R.M. 1:100 (- - - -). (ingombro sterico) CARATTERIZZAZIONE IN SOLUZIONE ACQUOSA: DC 200 225 250 270 300 325 350

  31. Chemical shifts CCB (R.M. 1:1 , 1:2 DM-β-Cyd ) CCB-DM-β-Cyd Shifts dell’H-4: probabile associazione con gli ossigeni metossilici della DM-β-Cyd (π) (R.M. 1:1, 1:2). Shifts a campi bassi degli H aromatici per la complessazione con il macrociclo: modificazione della polarità locale o effetto deschermante. Shifts a campi bassi più marcati dei protoni aromatici del toluene (R.M. 1:2). Inclusione CCB-HP-β-Cyd * Shift a campi alti H-4 (∆δ = - 0.021) (R.M. 1:3); Probabile effetto schermante degli ossigeni idrossipropilici della Cyd vicina H-4 Nessuna inclusione Metile * = complesso- CCB libero CARATTERIZZAZIONE IN SOLUZIONE ACQUOSA: 1H-NMR

  32. Chemical shifts DM-β-Cyd (R.M. 1:1 , 2:1 CCB) CCB-DM-β-Cyd Shifts a campi alti degli H-3 e H-5: probabile effetto schermante della corrente anisotropa del gruppo aromatico del CCB incluso nel macrociclo; Shifts a campi bassi degli H-1 e H-4: probabile perdita di rigidità del macrociclo per la complessazione; Shifts a campi alti dell’ H-5 (R.M. 1:2) non visibile per sovrapposizione dei protoni della Cyd. Inclusione  CARATTERIZZAZIONE IN SOLUZIONE ACQUOSA: 1H-NMR

  33. Gruppo solfonammidico non coinvolto nella complessazione; Gruppo toluenico inserito nel lato largo del macrociclo; Presenza di un secondo macrociclo con il lato stretto in prossimità del gruppo pirazolico del CCB: interazione superficiale. Protoni CCB irradiati Effetto NOE intenso Effetto NOE debole H-4 6’OCH3 . H-3 e H-5 2’OCH3 a’-b’-c’-d’ H-3 e 2’OCH3 H-5 e 6’OCH3 c-d nessuno nessuno Metile 6’OCH3 2’OCH3 . H-5 e H-3 CARATTERIZZAZIONE IN SOLUZIONE ACQUOSA: NOE

  34. CCB-DM-β-Cyd CCB-DM-β-Cyd, CCB-HP-β-Cyd (25°C) Ap AL Bs CCB (10–5) Concentrazione CCB (10–5) Concentrazione CCB (10–5) Ap HP-β-Cyd (M–3) () 25°C, () 37°C, () 45°C. Concentrazione DM--Cyd (10–3 M) Concentrazione DM--Cyd (10–3 M) () CCB-DM-β-Cyd, () CCB-HP-β-Cyd. DIAGRAMMI DI SOLUBILITÁ DI FASE

  35. Costanti di stabilità CCB-Cyds K1:1 (M-1) K1:2 (M-1) Temperatura (°C) CCB-DM-β-Cyd 9004.83 141.20 25 CCB-DM-β-Cyd 343.52 363.95 37 CCB-DM-β-Cyd 109.60 688.602 45 CCB-HP-β-Cyd 190.20 -- 25 Parametri termodinamici CCB-DM-β-Cyd H (calmol-1) S (calK-1mol-1) G (calmol-1) R.M. 1:1 -42.51 -124.58 -5.39 R.M. 1:2 14.94 59.88 -2.93 La formazione del complesso 1:1 è favorita da un contributo entalpico più che entropico (H, S negativi); esclusione di interazioni idrofobiche classiche (H, S positivi). L’associazione della seconda ciclodestrina (1:2) é favorita da S e H positivi PARAMETRI TERMODINAMICI

  36. Solubilità del CCB a 25°C 1) CCB 4.12 x 10-3 mg/ml; 2) CCB-DM-β-Cyd 0.5 mg/ml (freeze-dryed 1:2); % CCB dissolto 3) CCB-HP-β-Cyd 0.12 mg/ml (freeze-dryed 1:2). Tempo (min) () CCB libero; () miscela fisica CCB-HP--Cyd; () miscela fisica CCB-DM--Cyd; () sistema CCB-HP--Cyd; (x) complesso di inclusione CCB-DM--Cyd. STUDI DI DISSOLUZIONE E SOLUBILITÁ

  37. CaCo-2 Monostrati di cellule di carcinoma umano del colon. Modello di assorbimento gastro-intestinale. Celle di diffusione di tipo Franz % CCB permeato () CCB libero; () CCB-DM--Cyd 1:2 sospensionec; () CCB-DM--Cyd 1:5 complesso in soluzione; () CCB-DM--Cyd 1:10 complesso in soluzione. Tempo (ore) Significativo aumento della quantità totale di CCB permeato se complessato con la DM--Cyd; Rapida dissoluzione del CCB: aumento della quantitá in soluzione e al sito di assorbimento (1:2); Azione destabilizzante sulle biomembrane del macrociclo (1:5, 1:10) presente in eccesso rispetto al CCB. STUDI PERMEAZIONE IN VITRO: CACO-2

  38. Campioni Qs (μg/cm2) TL (h) Js (μg/cm2/ h) CCB 5.8±1.8 1.810.71 0.2610.06 A DM-β-Cyd CCB-DM-β-CyD (1.5 %) 16.9±2.6 0.630.20 0.6650.09 Qs (g/cm2) CCB-DM-β-CyD (3 %) 42.3±3.0 0.210.08 1.7900.07 CCB-DM-β-CyD (5 %) 46.4±4.0 0.130.31 1.8610.19 CCB-DM-β-CyD (10 %) 10.2±2.6 1.620.43 0.4540.07 CCB-HP-β-CyD (1.5 %) 8.2±1.9 0.59015 0.3390.12 CCB-HP-β-CyD (3 %) 36.2±3.9 0.420.22 1.5230.26 B CCB-HP-β-CyD (5 %) 40.4±4.5 0.240.16 1.6500.16 HP-β-Cyd CCB-HP-β-CyD (10 %) 21.3±4.1 1.020.29 0.9060.08 Qs (g/cm2) Tempo (ore) [A] () CCB; () CCB + 1.5 % DM; () CCB + 3 % DM; () CCB + 5 % DM; (x) CCB + 10 % DM. [B] () CCB; () CCB + 1.5 % HP; () CCB + 3 % HP; () CCB + 5 % HP; (x) CCB + 10 % HP. STUDI PERMEAZIONE IN VITRO: SCE • Aumento della quantità cumulativa di CCB permeata al crescere della quantità di entrambe le Cyds (1.5, 3, 5%); • CCB-Cyds 1.5% (sospensione): dissoluzione; • CCB-DM 3, 5% (soluzione): “penetration enhancer”; • CCB-HP 3, 5% (sospensione): dissoluzione; • Decremento consistente della permeazione al 10% di Cyds: K elevata ed equilibrio spostato verso il complesso.

  39. Competizione CCB-Cyds-SCE ANALISI ISTOLOGICA a)Controllo. b)CCB: azione invasiva, rottura lamine cornee e distruzione desmosomi. c)DM-β-Cyd: sfaldamento dello SC e separazione dei corneociti. d) HP-β-Cyd: nessun danno (controllo). e/f)Complessi: separazione corneociti ed imbibizione dello strato epidermico. Scarsa azione invasiva. Effetto protettivo. a) Controllo; b) CCB; c) DM--Cyd; d) HP--Cyd; e) CCB+DM--Cyd; f) CCB+HP--Cyd.

  40. CONCLUSIONI • La DM-β-Cyd è in grado di includere il CCB sia allo stato solido sia in soluzione, aumentandone la solubilità e la velocità di dissoluzione. • La HP-β-Cyd in presenza di CCB forma una dispersione allo stato solido, mentre in soluzione il farmaco interagisce solo esternamente con il macrociclo. • La DM-β-Cyd incrementa la permeazione del CCB attraverso monostrati di cellule CaCo-2.

  41. CONCLUSIONI • Gli studi di permeazione da SCE hanno evidenziato la capacità di entrambe le Cyds di migliorare l’assorbimento del CCB. I risultati migliori sono stati ottenuti con la DM-β-Cyd. • L’analisi istologica dei campioni di SCE ha messo in evidenza un effetto protettivo sullo strato corneo, esercitato dalle Cyds rispetto al farmaco libero. 1) C.A. Ventura, I. Giannone, D. Paolino, V. Pistarà, A. Corsaro G. Puglisi. Eur. J. Med. Chem. 40 (2005) 624-631. 2) C.A.Ventura, S.Tommasini, A.Falcone, I.Giannone, D.Paolino, V.Sdrafkakis, M.R. Mondello, G.Puglisi. Int. J. Pharm. 314 (2006) 37-45.

  42. OUTLINE • Ciclodestrine: struttura e proprietá • Scopo della ricerca • Studi di complessazione del Disoxaril • Studi di complessazione del Celecoxib • Studi di complessazione dell´Amiodarone • Considerazioni finali

  43. L´AMIODARONE (2-Butil-3-benzofuranil)[4-[2-(dietilamino)etossi]-3,5-diiodofenil]metanone cloridrato DM-β-Cyd HP-β-Cyd • Antiaritmico III classe. • Limitata solubilitá in H2O. • Bassa biodisponibilitá orale (~ 30%). • Somministrazione sistemica con s.o. • Accumulo (emivita 25-107 giorni). • Severi effetti tossici multi-organo.

  44. METODI • Preparazione (kneading e freeze-drying). • Caratterizzazione allo stato solido (DSC). • Caratterizzazione in soluzione (UV, DC, 1H-NMR, Diagrammi di solubilitá di fase). • Costanti di stabilitá. • Studi di dissoluzione.

  45. A B C ENDO D E 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 Nessuna interazione Temperatura °C CARATTERIZZAZIONE ALLO STATO SOLIDO: DSC Termogrammi AMI-HP-β-Cyd A) AMI (p.f. 163°C). B) HP--Cyd (55-90°C). C) Freeze-drying R.M. 1:1 e 1:2. D) Miscele fisiche R.M. 1:1 e 1:2. E) Freeze-drying R.M. 1:4.

  46. A B C D E ENDO F G 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 Temperatura (°C) CARATTERIZZAZIONE ALLO STATO SOLIDO: DSC Termogrammi AMI-DM-β-Cyd A) AMI (p.f. 163°C). B) DM-β-Cyd C) Kneading R.M. 1:1. D) Kneading R.M. 1:2. E) Miscele fisiche R.M. 1:1 e 1:2. F) Freeze-drying R.M. 1:1. G) Freeze-drying R.M. 1:2. • Interazione allo stato solido nel R.M. 1:1 e 1:2. • Formazione di una nuova fase solida a 206°C nei campioni ottenuti per kneading. • Riarrangiamento dei sistemi liofilizzati con passaggio da uno stato amorfo ad uno cristallino.

  47. CARATTERIZZAZIONE IN SOLUZIONE ACQUOSA: UV 1,000 AMI-DM--Cyd 1:100 AMI-DM--Cyd 1:10 AMI-DM--Cyd 1:5 AMI-DM--Cyd 1:2 AMI-DM--Cyd 1:1 AMI libero ABS 0,500 0,000 200 250 300 350 Lunghezza d’onda (nm) HP-β-Cyd • Bande di assorbimento a 218, 245 e 275 nm. • Marcato effetto ipercromico. • Perturbazione del microintorno dei cromofori elettronici del farmaco. Complessazione

  48. CARATTERIZZAZIONE IN SOLUZIONE ACQUOSA: DC AMI-DM-β-CD Nessuna banda DC per AMI libero 10.00 Due bande indotte (DCI) • negativa (218 nm) 5.00 • positiva (245 nm) 0.00 Esistenza di un complesso di inclusione in soluzione acquosa Ellitticitá Molare(10–4) -5.00 AMI-HP-β-Cyd -10.00 Nessuna banda DC indotta per tutti i rapporti molari 200 220 240 260 280 300 Lunghezza d´onda(nm) (ingombro sterico) Spettri DC AMI-DM-β-Cyd 1:100 1:10 1:5

  49. Protoni AMI libero Complesso di inclusione AMI-DM--Cyd 1:2 * H15-19 8.271 8.315 0.044 H10-11 7.661 7.690 0.029 H8-9 7.383 7.453 0.070 H20 4.538 4.558 0.020 H21 3.823 3.921 0.098 H22-25 3.604 3.595 -0.009 H4 2.845 2.918 0.073 H3 1.781 1.806 0.025 H24-23 1.516 1.529 0.013 H2 1.392 1.377 0.015 H1 0.931 0.967 0.036 CARATTERIZZAZIONE IN SOLUZIONE ACQUOSA: 1H-NMR • AMI-DM-β-CYD • Campi bassi H15-19 (effetto dechermante). • Campi alti H22-25 • Campi bassi H10-11 e H8-9 (benzofurano). • Modificazione della polarità locale. • Effetto schermante metossili Complessazione R.M. 1:2

  50. AMI-DM-β-CD • Campi alti degli H-5 e H3: probabile effetto schermante della corrente anisotropa del gruppo aromatico del l´AMI incluso nel macrociclo. • Shifts degli H-1 e H-4: probabile perdita di rigidità del macrociclo per la complessazione. Protoni DM--CD Complesso di inclusione AMI-DM--Cyd * H-1 5.213 5.190 -0,190 H-2 --- --- ---- H-3 3.871 3.795 -0.076 H-4 3.605 3.523 -0.082 H-5 3.740 3.700 -0.040 H-6 3.715 3.747 0.032 H Metil-2’ 3.478 3.462 -0.016 4 6 Metil-6’ 3.673 3.669 -0.016 O CH 3 O 5 H O H 3 H 2 H H 1 O CH 3 O 7 CARATTERIZZAZIONE IN SOLUZIONE ACQUOSA: 1H-NMR Complessazione

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